ಸುದ್ದಿ

Nature.com ಗೆ ಭೇಟಿ ನೀಡಿದ್ದಕ್ಕಾಗಿ ಧನ್ಯವಾದಗಳು.ನೀವು ಬಳಸುತ್ತಿರುವ ಬ್ರೌಸರ್ ಆವೃತ್ತಿಯು ಸೀಮಿತ CSS ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಉತ್ತಮ ಅನುಭವಕ್ಕಾಗಿ, ನೀವು ನವೀಕರಿಸಿದ ಬ್ರೌಸರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ನಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ (ಅಥವಾ ಇಂಟರ್ನೆಟ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ಲೋರರ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮೋಡ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿ).ಈ ಮಧ್ಯೆ, ನಿರಂತರ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು ಶೈಲಿಗಳು ಮತ್ತು ಜಾವಾಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಇಲ್ಲದೆ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ರೆಂಡರ್ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ.
ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಒತ್ತಡವನ್ನು ಜಯಿಸಲು ಮತ್ತು ಪ್ರಗತಿಯನ್ನು ಮುಂದುವರೆಸಲು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳು ವಿವಿಧ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ವಿಕಸನಗೊಳಿಸಿವೆ.ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕೈನೇಸ್ R (PKR) ಮತ್ತು ಅದರ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ (PACT) ಆರಂಭಿಕ ಪ್ರತಿಸ್ಪಂದಕಗಳಾಗಿವೆ, ಇದು ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣ ಮತ್ತು ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್‌ನ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ವಿವಿಧ ಒತ್ತಡ ಸಂಕೇತಗಳನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ PACT-PKR ಮಾರ್ಗದ ನಿಯಂತ್ರಣವು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ತಿಳಿದಿಲ್ಲ.ಇಲ್ಲಿ, ದೀರ್ಘ ನಾನ್-ಕೋಡಿಂಗ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ (ಎಲ್‌ಎನ್‌ಸಿಆರ್‌ಎನ್‌ಎ) ಆಸ್ಪರ್ಟೈಲ್ ಟಿಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಿಂಥೆಟೇಸ್ ಆಂಟಿಸೆನ್ಸ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ 1 (ಡಿಎಆರ್‌ಎಸ್-ಎಎಸ್1) ನೇರವಾಗಿ ಪಿಎಸಿಟಿ-ಪಿಕೆಆರ್ ಮಾರ್ಗದ ಪ್ರತಿಬಂಧಕದಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ ಮತ್ತು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ.CRISPRi 971 ಕ್ಯಾನ್ಸರ್-ಸಂಬಂಧಿತ lncRNA ಯ ದೊಡ್ಡ-ಪ್ರಮಾಣದ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, DARS-AS1 ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ವರ್ಧಿತ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳ ಪ್ರಸರಣದೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಔಟ್ ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿನ ವಿವಿಧ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳ ರೇಖೆಗಳಲ್ಲಿ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶ ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್ ಅನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ವಿವೊದಲ್ಲಿ ಗೆಡ್ಡೆಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಯಾಂತ್ರಿಕವಾಗಿ, DARS-AS1 ನೇರವಾಗಿ PACT ಆಕ್ಟಿವೇಶನ್ ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು PACT-PKR ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ PKR ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ, eIF2α ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಮತ್ತು ಅಪೊಪ್ಟೋಟಿಕ್ ಜೀವಕೋಶದ ಮರಣವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ.ಪ್ರಾಯೋಗಿಕವಾಗಿ, DARS-AS1 ಅನ್ನು ಬಹು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಈ lncRNA ಯ ಅತಿಯಾದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ಕಳಪೆ ಮುನ್ನರಿವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಈ ಅಧ್ಯಯನವು DARS-AS1 lncRNA ಯಿಂದ PACT-PKR ಮಾರ್ಗದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಮುನ್ನರಿವು ಮತ್ತು ಚಿಕಿತ್ಸೆಗೆ ಮತ್ತೊಂದು ಗುರಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.
ಒತ್ತಡಕ್ಕೆ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳ ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಸರಣದ ಪ್ರಮುಖ ಲಕ್ಷಣವಾಗಿದೆ.ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ನ ಕ್ಷಿಪ್ರ ಪ್ರಸರಣ ಮತ್ತು ಮೆಟಬಾಲಿಕ್ ಲಕ್ಷಣಗಳು ಕಠಿಣವಾದ ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ-ಪೋಷಕಾಂಶದ ಅಭಾವ, ಹೈಪೋಕ್ಸಿಯಾ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ pH-ಇದು ಜೀವಕೋಶದ ಸಾವಿನ ಸಂಕೇತದ ಮಾರ್ಗಗಳನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸುತ್ತದೆ.ಒತ್ತಡ-ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಜೀನ್‌ಗಳಾದ p535, ಹೀಟ್ ಶಾಕ್ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳು 6, 7, KRAS8, 9, ಮತ್ತು HIF-110, 11, 12, 13 ಗಳ ಅನಿಯಂತ್ರಣವು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ನಲ್ಲಿ ಆಗಾಗ್ಗೆ ಕಂಡುಬರುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್ ಅನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ.
ಪ್ರೊಟೀನ್ ಕೈನೇಸ್ R (PKR) ಯುಕಾರ್ಯೋಟಿಕ್ ಇನಿಶಿಷನ್ ಫ್ಯಾಕ್ಟರ್ 2α (eIF2α) ನ ಪ್ರಮುಖ ಒತ್ತಡ ಸಂವೇದಕ ಮತ್ತು ಉಪಘಟಕ ಕೈನೇಸ್ ಆಗಿದೆ, ಇದು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಒತ್ತಡವನ್ನು ಜೀವಕೋಶದ ಸಾವಿನೊಂದಿಗೆ ಸಂಪರ್ಕಿಸುವ ಭಾಷಾಂತರ ನಿಯಂತ್ರಕವಾಗಿದೆ.ವಿದೇಶಿ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ (ಡಿಎಸ್‌ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ) ಪತ್ತೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಪಿಕೆಆರ್ ಅನ್ನು ಮೂಲತಃ ಆಂಟಿವೈರಲ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಎಂದು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ.ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದ ನಂತರ, ವೈರಲ್ ಮತ್ತು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ 14,15,16 ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಲು PKR eIF2α ಅನ್ನು ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ.dsRNA17,18,19,20,21,22,23 ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ PACT (PKR ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ ಪ್ರೊಟೀನ್) ಅನ್ನು ಮೊದಲ PKR ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಎಂದು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ.PKR ನೊಂದಿಗೆ ನೇರ ಸಂವಹನದ ಮೂಲಕ, PACT ವಿವಿಧ ಒತ್ತಡಗಳನ್ನು (ಸೀರಮ್ ಹಸಿವು, ಪೆರಾಕ್ಸೈಡ್ ಅಥವಾ ಆರ್ಸೆನೈಟ್ ಚಿಕಿತ್ಸೆ) PKR ಮತ್ತು ಡೌನ್‌ಸ್ಟ್ರೀಮ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಮಾರ್ಗಗಳಿಗೆ ರವಾನಿಸುತ್ತದೆ.eIF2α ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಜೊತೆಗೆ, PACT-ಮಧ್ಯಸ್ಥ PKR ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯು ಒತ್ತಡದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ವಿವಿಧ ಘಟನೆಗಳನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸುತ್ತದೆ, PI3K/Akt24 ಮಾರ್ಗದ ಮೂಲಕ ಬದಲಾದ ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಸ್ಥಿತಿ, p5325,26 ಮೂಲಕ ವರ್ಧಿತ DNA ಹಾನಿ ಪರಿಶೀಲನೆ ಮತ್ತು NF-κB27,28, 29 ಪ್ರತಿಲೇಖನವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ. ಒತ್ತಡದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ, ಪ್ರಸರಣ, ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್ ಮತ್ತು ಇತರ ಪ್ರಮುಖ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಅವರ ನಿರ್ಣಾಯಕ ಪಾತ್ರವನ್ನು ನೀಡಲಾಗಿದೆ, PKR ಮತ್ತು PACT ಅನೇಕ ರೋಗಗಳಿಗೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್30,31,32,33 ಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಭರವಸೆ ನೀಡುತ್ತವೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಪ್ಲಿಯೋಟ್ರೋಪಿಕ್ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ PACT/PKR ಚಟುವಟಿಕೆಯ ನಿಯಂತ್ರಣವು ಅಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ಉಳಿದಿದೆ.
lncRNA ಗಳು 200 ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ದೊಡ್ಡದಾದ ಪ್ರತಿಲೇಖನಗಳಾಗಿವೆ ಮತ್ತು ಯಾವುದೇ ಪ್ರೋಟೀನ್-ಕೋಡಿಂಗ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವಿಲ್ಲ.ಅತ್ಯಾಧುನಿಕ ಸಂಪೂರ್ಣ ಜೀನೋಮ್ ಅನುಕ್ರಮ ಯೋಜನೆಗಳು ಸಾವಿರಾರು ಎಲ್‌ಎನ್‌ಸಿಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಿರುವುದರಿಂದ, ಅವುಗಳ ಜೈವಿಕ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟಪಡಿಸಲು 35,36 ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಯತ್ನಗಳನ್ನು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.X-ಕ್ರೋಮೋಸೋಮ್ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ 38,39, ಇಂಪ್ರಿಂಟಿಂಗ್ 40, ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್41,42, ಅನುವಾದ43 ಮತ್ತು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಬೆಳವಣಿಗೆ44,45,46,47 ರ ನಿಯಂತ್ರಣ ಸೇರಿದಂತೆ ಅನೇಕ ಜೈವಿಕ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ lncRNA ಗಳು ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿವೆ ಎಂದು ಸಂಶೋಧನೆಯ ಒಂದು ಬೆಳೆಯುತ್ತಿರುವ ದೇಹವು ತೋರಿಸಿದೆ.ಈ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಅನೇಕ lncRNAಗಳು PACT/PKR ಮಾರ್ಗದಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಕೊಂಡಿವೆ ಎಂದು ವರದಿ ಮಾಡಿದೆ.ಅಂತಹ ಒಂದು ಅಧ್ಯಯನವು lncRNA ASPACT PACT ಪ್ರತಿಲೇಖನವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು PACT mRNA ಯ ಪರಮಾಣು ಧಾರಣವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ.ಇತರ ಅಧ್ಯಯನಗಳು lncRNA nc886 PKR ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅದರ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ 49,50 ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ.ಇಲ್ಲಿಯವರೆಗೆ, PACT-ಮಧ್ಯಸ್ಥ PKR ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ lncRNA ವರದಿಯಾಗಿಲ್ಲ.
Aspartyl-tRNA ಸಿಂಥೆಟೇಸ್ ಆಂಟಿಸೆನ್ಸ್ RNA 1 (DARS-AS1) ಅನ್ನು ಆಂಕೊಜೆನಿಕ್ lncRNA51,52,53,54 ಎಂದು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ.miP-194-5p53, miP-12952 ಮತ್ತು miP-532-3p51 ನಿಯಂತ್ರಣದ ಮೂಲಕ, DARS-AS1 ಕ್ರಮವಾಗಿ ಸ್ಪಷ್ಟ ಜೀವಕೋಶದ ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಜೀವಕೋಶದ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ, ಥೈರಾಯ್ಡ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ-ಅಲ್ಲದ ಜೀವಕೋಶದ ಶ್ವಾಸಕೋಶದ ಕಾರ್ಸಿನೋಮದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.DARS-AS1 ಪ್ರೋಟೀನ್ 39 (RBM39) ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಮೋಟಿಫ್‌ನ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಕಾಪಾಡಿಕೊಳ್ಳುವ ಮೂಲಕ ಮೈಲೋಮಾ ಪ್ರಗತಿಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಟಾಂಗ್ ಮತ್ತು ಸಹೋದ್ಯೋಗಿಗಳು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದಾರೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ lncRNA PACT-PKR ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳ ಒತ್ತಡದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿದೆಯೇ ಎಂಬುದರ ಕುರಿತು ಯಾವುದೇ ಅಧ್ಯಯನಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಗಿಲ್ಲ.
ಇಲ್ಲಿ, ನಾವು CRISPRi ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದ ನಷ್ಟ-ಕಾರ್ಯ ಪರದೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು DARS-AS1 lncRNA ಹಲವಾರು ವಿಧದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ನಾವು ಪ್ರಮುಖ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ: DARS-AS1 ನೇರವಾಗಿ PACT ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, PACT ಮತ್ತು PKR ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, eIF2α ನ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ, ಕಡಿಮೆ PKR ತಲಾಧಾರ, ಮತ್ತು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಅಪೊಪ್ಟೋಟಿಕ್ ಜೀವಕೋಶದ ಮರಣವನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ.ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ, ನಮ್ಮ ಕೆಲಸವು PACT-PKR ಮಾರ್ಗದ ನಿಯಂತ್ರಕವಾಗಿ DARS-AS1 lncRNA ಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಮತ್ತು ಮುನ್ನರಿವಿನ ಸಂಭಾವ್ಯ ಗುರಿಯಾಗಿದೆ.
ವ್ಯಾಪಕವಾದ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಪ್ರೊಫೈಲಿಂಗ್ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ನೂರಾರು ಎಲ್‌ಎನ್‌ಸಿಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಿವೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಅವರ ಕಾರ್ಯವು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ತಿಳಿದಿಲ್ಲ56.ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಪ್ರಗತಿಯಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿರುವ ಭರವಸೆಯ lncRNA ಅಭ್ಯರ್ಥಿಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು, CRISPRi ಸಿಸ್ಟಮ್ (Fig. 1a) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು SW620 ಕೊಲೊರೆಕ್ಟಲ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಸೆಲ್ ಲೈನ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಸರಣಕ್ಕಾಗಿ ನಾವು ಕಾರ್ಯದ ನಷ್ಟದ ಪರದೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದ್ದೇವೆ.SW480 ಮತ್ತು SW620 ಕೊಲೊನ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶ ರೇಖೆಗಳ ವಿಶಿಷ್ಟ ಲಕ್ಷಣವೆಂದರೆ ಅವು ಒಂದೇ ರೋಗಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಮತ್ತು ದ್ವಿತೀಯಕ ಗೆಡ್ಡೆಗಳಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.ಮುಂದುವರಿದ ಕೊಲೊನ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ನ ಪ್ರಗತಿಯಲ್ಲಿನ ಆನುವಂಶಿಕ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಇದು ಅಮೂಲ್ಯವಾದ ಹೋಲಿಕೆಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕೊಲೊರೆಕ್ಟಲ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಸೆಲ್ ಲೈನ್‌ಗಳ (SW480 ಮತ್ತು SW620) ಪ್ರತಿಲೇಖನಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಕಟಿತ ಸಾಹಿತ್ಯದಿಂದ ಕೆಲವು ಸಂಭಾವ್ಯ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ lncRNA ಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ, ನಾವು 971 ಕ್ಯಾನ್ಸರ್-ಸಂಬಂಧಿತ lncRNA ಗಳನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಟ್ಟುಕೊಂಡು 7355 sgRNA ಒಲಿಗೋಸ್ ಮತ್ತು ಋಣಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣಕ್ಕಾಗಿ 500 ಗುರಿಯಿಲ್ಲದ sgRNA ಆಲಿಗೋಸ್ ಹೊಂದಿರುವ ಪೂಲ್ ಮಾಡಿದ sgRNA ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಪೂರಕ ಡೇಟಾ 1).
CRISPRi ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ನ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯ.ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ನಂತರ b sgRNA ಪುಷ್ಟೀಕರಣ.ಸಮತಲವಾದ ಚುಕ್ಕೆಗಳ ರೇಖೆಯು log2 (ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ) = ±0.58 ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.ಲಂಬ ಚುಕ್ಕೆಗಳ ರೇಖೆಯು p ಮೌಲ್ಯ = 0.05 ಅನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಕಪ್ಪು ಚುಕ್ಕೆಗಳು ಗುರಿಯಲ್ಲದ sgRNA (NC ಎಂದು ಗೊತ್ತುಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ) ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ.ಕೆಂಪು ಚುಕ್ಕೆಗಳು DARS-AS1 ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸುವ sgRNAಗಳಾಗಿವೆ.ನೀಲಿ ಚುಕ್ಕೆಗಳು LINC00205 ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸುವ sgRNAಗಳಾಗಿವೆ, ಇದು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ ಆಂಕೊಜೆನಿಕ್ lncRNA.ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ = (ಸಾಮಾನ್ಯ ಓದುವಿಕೆ, ದಿನ 17)/(ಸಾಮಾನ್ಯ ಓದುವಿಕೆ, ದಿನ 0).c DARS-AS1 sgRNA ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಜೀವಕೋಶದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ.ದೋಷ ಪಟ್ಟಿಗಳು ಮೂರು ಪ್ರಯೋಗಗಳ ± ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 ಎರಡು ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆ.ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿ d DARS-AS1 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ (TCGA ಡೇಟಾಸೆಟ್).em ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP ಮತ್ತು COAD ಹೊಂದಿರುವ ರೋಗಿಗಳ ಜೋಡಿಯ ಸಾಮಾನ್ಯ ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ DARS-AS1 ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ (TCGA ಡೇಟಾಸೆಟ್).p-ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಜೋಡಿಯಾಗಿರುವ ಎರಡು-ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.
ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ಮಿಸಿದ ನಂತರ ಮತ್ತು ಲೆಂಟಿವೈರಸ್ ಅನ್ನು ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, ನಾವು ನಾಲ್ಕು ಸ್ವತಂತ್ರ ಸೋಂಕಿನ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಮೇಲಿನ ಲೈಬ್ರರಿಯೊಂದಿಗೆ dCas9-SW620 ಕೊಲೊರೆಕ್ಟಲ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಸೆಲ್ ಲೈನ್ ಅನ್ನು ರವಾನಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಈ ಸೋಂಕುಗಳಿಗೆ ಸೋಂಕಿನ ಬಹುಸಂಖ್ಯೆಯು (MOI) 0.1-0.3 ಆಗಿತ್ತು, ಇದು ಪ್ರತಿ ಕೋಶವನ್ನು ಒಂದು sgRNA ಯೊಂದಿಗೆ ಮಾತ್ರ ವರ್ಗಾಯಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.18 ದಿನಗಳ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯ ನಂತರ, ಗುರಿ sgRNA ಗಳ ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ಪ್ರೊಫೈಲ್ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ನಂತರ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಾಯಿತು, ಆದರೆ ಗುರಿಯಿಲ್ಲದ ನಿಯಂತ್ರಣ ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯು ಪೂರ್ವ-ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಬದಲಾಗದೆ ಉಳಿದಿದೆ, ಇದು ನಮ್ಮ ಗುರಿಯು ಹೆಚ್ಚು ಪರದೆಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಗ್ರಂಥಾಲಯ.ಅಕ್ಕಿ.1b ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 1). LINC00205, ಶ್ವಾಸಕೋಶದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಮತ್ತು ಪಿತ್ತಜನಕಾಂಗದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಪ್ರಗತಿ58,59,60 ಅನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಈ ಹಿಂದೆ ವರದಿ ಮಾಡಲಾಗಿತ್ತು, (log2 (ಫೋಲ್ಡ್‌ಚೇಂಜ್) <-0.58, p ಮೌಲ್ಯ <0.05), ಈ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ನ ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹತೆಯನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸುತ್ತದೆ (Fig. 1b). LINC00205, ಶ್ವಾಸಕೋಶದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಮತ್ತು ಪಿತ್ತಜನಕಾಂಗದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಪ್ರಗತಿ58,59,60 ಅನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಈ ಹಿಂದೆ ವರದಿ ಮಾಡಲಾಗಿತ್ತು, (log2 (ಫೋಲ್ಡ್‌ಚೇಂಜ್) <-0.58, p ಮೌಲ್ಯ <0.05), ಈ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ನ ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹತೆಯನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸುತ್ತದೆ (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, ಶ್ವಾಸಕೋಶದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಮತ್ತು ಪಿತ್ತಜನಕಾಂಗದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ 58,59,60 ನ ಪ್ರಗತಿಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಹಿಂದೆ ವರದಿ ಮಾಡಲಾಗಿತ್ತು, ಇದನ್ನು ಹೊರಗಿಡಲಾಗಿದೆ (log2 (ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ) <-0.58, p-ಮೌಲ್ಯ <0.05), ಈ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ನ ದೃಢತೆಯನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸುತ್ತದೆ (Fig. .1b) . Linc00205 之前 被 可 促进 肺癌 和 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 （log log log log log （变化 <-0.58 ， p 值 <<0.05 ， 证实 了 该 筛选 筛选 的 的 可靠性 可靠性 （（（（（（ Linc00205 之前 被 可 促进 肺癌 和 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 （log log log log log （变化 <-0.58 ， p 值 <<0.05 ， 证实 了 该 筛选 筛选 的 的 可靠性 可靠性 （（（（（（ LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, ಶ್ವಾಸಕೋಶ ಮತ್ತು ಯಕೃತ್ತಿನ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಪ್ರಗತಿಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಈ ಹಿಂದೆ ವರದಿಯಾಗಿದೆ58,59,60, ಹೊರಗಿಡಲಾಗಿದೆ (log2 (ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ) <-0.58, p-ಮೌಲ್ಯ <0.05), ಈ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ನ ದೃಢತೆಯನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸುತ್ತದೆ (Fig. .1b).
ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ ಎಲ್ಲಾ lncRNA ಗಳಲ್ಲಿ, DARS-AS1 ಅನ್ನು ಸಹ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಯಿತು, 18 ದಿನಗಳ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯ ನಂತರ ಮೂರು ಕಾಗ್ನೇಟ್ sgRNA ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾದವು, ಈ lncRNA ಯ ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಕಡಿಮೆಯಾದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಪ್ರಸರಣಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (Fig. 1b).ಕೊಲೊರೆಕ್ಟಲ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ MTS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಈ ಫಲಿತಾಂಶವು ಮತ್ತಷ್ಟು ಬೆಂಬಲಿತವಾಗಿದೆ, ನಿಯಂತ್ರಣ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಕೋಶಗಳ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ದರವು ಅರ್ಧದಷ್ಟು ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1c) ಮತ್ತು ಹಲವಾರು ಇತರ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಪ್ರಕಾರಗಳ ಹಿಂದಿನ ವರದಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ.: ಕ್ಲಿಯರ್ ಸೆಲ್ ಕಿಡ್ನಿ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್, ಥೈರಾಯ್ಡ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಮತ್ತು ನಾನ್ ಸ್ಮಾಲ್ ಸೆಲ್ ಶ್ವಾಸಕೋಶದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್51,52,53,55.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕೊಲೊರೆಕ್ಟಲ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ನಲ್ಲಿ ಅದರ ಕಾರ್ಯ ಮತ್ತು ಆಣ್ವಿಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳು ಅನ್ವೇಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿಲ್ಲ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಧ್ಯಯನಕ್ಕಾಗಿ ನಾವು ಈ lncRNA ಅನ್ನು ಆರಿಸಿದ್ದೇವೆ.
ರೋಗಿಗಳಲ್ಲಿ DARS-AS1 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು, ನಾವು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಜಿನೋಮ್ ಅಟ್ಲಾಸ್ (TCGA) ಯೋಜನೆಯಿಂದ 10,327 ಟ್ಯೂಮರ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಮಗ್ರವಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಕೊಲೊನ್ ಅಡಿನೊಕಾರ್ಸಿನೋಮ (COAD), ರೀನಲ್ ಕ್ಲಿಯರ್ ಸೆಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (KIRC) ಮತ್ತು ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಪ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ಸೆಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (KIRP) ಸೇರಿದಂತೆ ವಿವಿಧ ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿನ ಆರೋಗ್ಯಕರ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ DARS-AS1 ಅನ್ನು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ..ಬಹಳ ಕಡಿಮೆ (Fig. 1d ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 1a, b). ಜೋಡಿಯಾಗಿರುವ ಆರೋಗ್ಯಕರ/ಗೆಡ್ಡೆಯ ಮಾದರಿಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಗಾಳಿಗುಳ್ಳೆಯ ಯುರೊಥೆಲಿಯಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (BLCA), ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಸ್ಪಷ್ಟ ಜೀವಕೋಶದ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (KIRC), ಪ್ರಾಸ್ಟೇಟ್ ಅಡಿನೊಕಾರ್ಸಿನೋಮ (PRAD), ಶ್ವಾಸಕೋಶದ ಸ್ಕ್ವಾಮಸ್ ಸೆಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (LUSC) ಯ ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿ DARS-AS1 ನ ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ದೃಢಪಡಿಸಿತು. , ಗರ್ಭಾಶಯದ ಕಾರ್ಪಸ್ ಎಂಡೊಮೆಟ್ರಿಯಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (UCEC), ಶ್ವಾಸಕೋಶದ ಅಡಿನೊಕಾರ್ಸಿನೋಮ (LUAD), ಯಕೃತ್ತು ಹೆಪಟೊಸೆಲ್ಯುಲರ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (LIHC), ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಪ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ಸೆಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (KIRP), ಮತ್ತು ಕೊಲೊನ್ ಅಡಿನೊಕಾರ್ಸಿನೋಮ (COAD) (p ಮೌಲ್ಯ <0.05) (Fig. 1e-m) . ಜೋಡಿಯಾಗಿರುವ ಆರೋಗ್ಯಕರ/ಗೆಡ್ಡೆಯ ಮಾದರಿಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಗಾಳಿಗುಳ್ಳೆಯ ಯುರೊಥೆಲಿಯಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (BLCA), ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಸ್ಪಷ್ಟ ಜೀವಕೋಶದ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (KIRC), ಪ್ರಾಸ್ಟೇಟ್ ಅಡಿನೊಕಾರ್ಸಿನೋಮ (PRAD), ಶ್ವಾಸಕೋಶದ ಸ್ಕ್ವಾಮಸ್ ಸೆಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (LUSC) ಯ ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿ DARS-AS1 ನ ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ದೃಢಪಡಿಸಿತು. , ಗರ್ಭಾಶಯದ ಕಾರ್ಪಸ್ ಎಂಡೊಮೆಟ್ರಿಯಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (UCEC), ಶ್ವಾಸಕೋಶದ ಅಡಿನೊಕಾರ್ಸಿನೋಮ (LUAD), ಯಕೃತ್ತು ಹೆಪಟೊಸೆಲ್ಯುಲರ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (LIHC), ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಪ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ಸೆಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (KIRP), ಮತ್ತು ಕೊಲೊನ್ ಅಡಿನೊಕಾರ್ಸಿನೋಮ (COAD) (p ಮೌಲ್ಯ <0.05) (Fig. 1e-m) .ಜೋಡಿಯಾಗಿರುವ ಆರೋಗ್ಯಕರ/ಗೆಡ್ಡೆ ಮಾದರಿಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಗಾಳಿಗುಳ್ಳೆಯ ಯುರೊಥೆಲಿಯಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (BLCA), ಕ್ಲಿಯರ್ ಸೆಲ್ ಮೂತ್ರಪಿಂಡ ಮತ್ತು ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಜೀವಕೋಶದ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (KIRC), ಪ್ರಾಸ್ಟೇಟ್ ಅಡಿನೊಕಾರ್ಸಿನೋಮ (PRAD), ಶ್ವಾಸಕೋಶದ ಸ್ಕ್ವಾಮಸ್ ಸೆಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (LUSC) ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿ DARS-AS1 ನ ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿದೆ., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– ಮೀ) , ಕಾರ್ಪಸ್ ಗರ್ಭಾಶಯದ ಎಂಡೊಮೆಟ್ರಿಯಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (UCEC), ಶ್ವಾಸಕೋಶದ ಅಡೆನೊಕಾರ್ಸಿನೋಮ (LUAD), ಯಕೃತ್ತಿನ ಹೆಪಟೊಸೆಲ್ಯುಲರ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (LIHC), ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಪ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ಸೆಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (KIRP), ಮತ್ತು ಕೊಲೊನ್ನ ಅಡಿನೊಕಾರ್ಸಿನೋಮ (COAD) (p ಮೌಲ್ಯ < 0.05) (ಚಿತ್ರ 1e– ಮೀ) .. . <0.05）（图1e-m） .. .癌 (kirp）) (ಕೋಡ್) （p 值<0.05）（图1e-m） .ಆರೋಗ್ಯಕರ/ಗೆಡ್ಡೆ ಜೋಡಿಯಾಗಿರುವ ಮಾದರಿಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಮೂತ್ರಕೋಶದ ಯುರೊಥೆಲಿಯಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (BLCA), ಕ್ಲಿಯರ್ ಸೆಲ್ ರೀನಲ್ ಸೆಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (KIRC), ಪ್ರಾಸ್ಟೇಟ್ ಅಡಿನೊಕಾರ್ಸಿನೋಮ (PRAD) ಮತ್ತು ಶ್ವಾಸಕೋಶದ ಸ್ಕ್ವಾಮಸ್ ಸೆಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (LUSC) ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿ DARS-AS1 ಪಾತ್ರವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಬೆಂಬಲಿಸಿತು.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ಕಾರ್ಪಸ್ ಗರ್ಭಾಶಯದ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (UCEC), ಶ್ವಾಸಕೋಶದ ಅಡಿನೊಕಾರ್ಸಿನೋಮ (LUAD), ಹೆಪಟೊಸೆಲ್ಯುಲರ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (LIHC), ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಪ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ಸೆಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (KIRP), ಮತ್ತು ಕೊಲೊನ್ ಅಡಿನೊಕಾರ್ಸಿನೋಮ (COAD) (p ಮೌಲ್ಯ <0.05) (ಚಿತ್ರ 1e -m).ಒಟ್ಟಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು DARS-AS1 ವಿವಿಧ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚು ವ್ಯಕ್ತವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
DARS-AS1 ಮತ್ತು DARS (ಆಂಟಿಸೆನ್ಸ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಅನ್ನು ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಜೀನ್) ಒಂದೇ ಪ್ರವರ್ತಕವನ್ನು ಹಂಚಿಕೊಳ್ಳುವುದರಿಂದ ಮತ್ತು ಪರಸ್ಪರ ಪಕ್ಕದಲ್ಲಿ ನೆಲೆಗೊಂಡಿರುವುದರಿಂದ, ನಾವು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ DARS-AS1 ಅನ್ನು ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಮಾಡಲು shRNA ಅನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದ್ದೇವೆ ಆದರೆ DARS ಅಲ್ಲ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ. 2a,b ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 2 ) .SW620 ಜೊತೆಗೆ, shRNA ನಾಕ್‌ಡೌನ್‌ನ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿತ್ವ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ನಾವು DARS-AS1 ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಮೂರು ಇತರ ಸೆಲ್ ಲೈನ್‌ಗಳನ್ನು ಸಹ ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಟೇಬಲ್ 3).ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ ಎಲ್ಲಾ ಮೂರು shRNAಗಳು ಕನಿಷ್ಠ 80% DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಸಾಧಿಸಿವೆ ಮತ್ತು DARS mRNA (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ Fig. 2c-f) ಪ್ರಮಾಣದ ಮೇಲೆ ಕಡಿಮೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸಿದೆ.ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಈ shRNAಗಳೊಂದಿಗೆ DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಕೊಲೊರೆಕ್ಟಲ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶದ SW620 (49.7%) ಮತ್ತು HCT116 (27.7%), ಸ್ತನ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶದ MBA-MD-231 (53.4%) ನಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ.) ಮತ್ತು HepG2 ಹೆಪಟೋಮಾ ಸೆಲ್ ಲೈನ್ (92.7% ಕಡಿತ), ಹಾಗೆಯೇ ಆಧಾರರಹಿತ ಗೋಳಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುವ ಅವರ ಸಾಮರ್ಥ್ಯ (ಸರಾಸರಿ ಕಡಿತ ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% ಮತ್ತು 75.7% ಪ್ರತಿ ಕೋಶ ರೇಖೆ) (Fig. 2a,b).SW620 ರಲ್ಲಿ, ವಸಾಹತು ರಚನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು DARS-AS1 shRNA ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಸುಮಾರು 69.6% ನಷ್ಟು ಸರಾಸರಿ ಇಳಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ (Fig. 2c).
SW620, HCT116, MBA-MD-231, ಮತ್ತು HepG2 ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಕೋಶ ಪ್ರಸರಣ (a) ಮತ್ತು ಗೋಳ ರಚನೆ (b) ಮೇಲೆ ನಿಯಂತ್ರಣ shRNA ಮತ್ತು DARS-AS1 shRNA ಪರಿಣಾಮ.c SW620 ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ವಸಾಹತು ರಚನೆಯ ಮೇಲೆ ನಿಯಂತ್ರಣ shRNA ಮತ್ತು DARS-AS1 shRNA ಪರಿಣಾಮ.ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣ (d), ಗೋಳಾಕಾರದ ರಚನೆ (e), ಮತ್ತು SW620 ಕೋಶಗಳ ವಸಾಹತು ರಚನೆ (f) DARS-AS1 ಅನ್ನು ಅತಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುತ್ತದೆ.ತೋರಿಸಲಾದ ಡೇಟಾವು ಮೂರು ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಸರಾಸರಿ ± ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವಾಗಿದೆ.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, ಮತ್ತು *** p ≤ 0.001 ಎರಡು ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯಿಂದ.
ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಣೆಯ ನಷ್ಟದ ಅಧ್ಯಯನಗಳಿಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿ, ನಾವು ಮುಂದೆ DARS-AS1 (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ Fig. 2g) ಅತಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ SW620 ಕೋಶಗಳನ್ನು ರಚಿಸಿದ್ದೇವೆ.DARS-AS1 ಮಿತಿಮೀರಿದ ಒತ್ತಡವು SW620 ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ (Fig. 2d-f) ಜೀವಕೋಶದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು (1.8-ಪಟ್ಟು), ಆಧಾರರಹಿತ ಗೋಳಾಕಾರದ ರಚನೆ (1.4-ಪಟ್ಟು) ಮತ್ತು ವಸಾಹತು ರಚನೆಯನ್ನು (3.3-ಪಟ್ಟು) ಹೆಚ್ಚಿಸಿತು.ನಾವು ಮತ್ತೊಂದು DARS-AS1 ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ರೆಸ್ ಸೆಲ್ ಲೈನ್, A549 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಈ ಫಲಿತಾಂಶವನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ.DARS-AS1 ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡದಿಂದಾಗಿ ಈ ವರ್ಧಿತ ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು A549 ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ (ಪೂರಕ Fig. 2h, i ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 3) ಮತ್ತಷ್ಟು ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು.ಒಟ್ಟಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ಈ ಲಾಭ ಮತ್ತು ನಷ್ಟದ ಅಧ್ಯಯನಗಳು DARS-AS1 ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
DARS-AS1 ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಆಧಾರವಾಗಿರುವ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಅನ್ವೇಷಿಸಲು, ನಾವು ಅದರ ಸಂಭಾವ್ಯ ಪ್ರೋಟೀನ್-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪಾಲುದಾರರನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು RNA ಪುಲ್-ಡೌನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ.RT-qPCR ಫಲಿತಾಂಶಗಳು DARS-AS1 ನ ಸುಮಾರು 86.2% SW620 ಜೀವಕೋಶಗಳ ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸಂನಲ್ಲಿ ನೆಲೆಗೊಂಡಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 3a).ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೆಡ್ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ DARS-AS1 ಅಥವಾ ಸ್ಯೂಡೋಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ನಂತರ SW620 ಸೆಲ್ ಲೈಸೇಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ SDS-PAGE ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು.ನಂತರದ ಬೆಳ್ಳಿಯ ಕಲೆಯು DARS-AS1 ಪುಲ್ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದು ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಬ್ಯಾಂಡ್ (~38 kDa) ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ ಆದರೆ ನಕಲಿ RNA ಅಥವಾ ಮಣಿಗಳ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಅಲ್ಲ (Fig. 3a).ಈ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಅನ್ನು ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ (MS) ಮೂಲಕ PKR ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ ಪ್ರೊಟೀನ್ (PACT) ಎಂದು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು SW620, HCT116, ಮತ್ತು HepG2 ಸೆಲ್ ಲೈನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (Fig. 3a,b) ಇಮ್ಯುನೊಬ್ಲೋಟಿಂಗ್ ಮೂಲಕ ಮತ್ತಷ್ಟು ದೃಢೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ.DARS ಮತ್ತು ಸಂಬಂಧಿತ PACT ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ - PKR ಮತ್ತು TRBP - ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟಿಂಗ್ (WB) ಮೂಲಕ RNA ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ತನಿಖೆ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.DARS-AS1 RNA ಮತ್ತು ಈ ಮೂರು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಯಾವುದೇ ನೇರವಾದ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆ ಕಂಡುಬಂದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸೂಚಿಸಿವೆ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ Fig. 3b).DARS-AS1 ಮತ್ತು PACT ನಡುವಿನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು RNA ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಶನ್ (RIP) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಮತ್ತಷ್ಟು ದೃಢೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ, ಇದು DARS-AS1 ಅನ್ನು ಆಂಟಿ-PACT ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದೆ ಆದರೆ ಇತರ ನಿಯಂತ್ರಣ RNA ಗಳಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 3c).ಯಾವುದೇ ಇತರ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಘಟಕಗಳ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ DARS-AS1 ನೇರವಾಗಿ PACT ಯೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುತ್ತದೆಯೇ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಲು, ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ PACT ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಬಯೋಲೇಯರ್ ಇಂಟರ್ಫೆರೊಮೆಟ್ರಿ (BLI) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಬಯೋಟಿನ್-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ DARS-AS1 ಅಥವಾ ನಕಲಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅನ್ನು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ (ಎಸ್‌ಎ) ಬಯೋಸೆನ್ಸರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ನಿಶ್ಚಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ 1 μM PACT ಹೊಂದಿರುವ ಕೈನೆಟಿಕ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, PACT DARS-AS1 (KD ಮೌಲ್ಯ ~26.9 nM) ಗೆ ಬಲವಾಗಿ ಬದ್ಧವಾಗಿದೆ, ಆದರೆ RNA ಅನ್ನು ಅನುಕರಿಸಲು ಅಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 3d).ಒಟ್ಟಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು DARS-AS1 ಮತ್ತು PACT ನಡುವಿನ ನೇರ ಸಂವಾದ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತವೆ.
RNA ಪುಲ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು DARS-AS1 SW620 ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ PACT ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುವುದನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದೆ.ಮೇಲೆ, ಸಂಬಂಧಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಬೆಳ್ಳಿಯ ಬಣ್ಣ.ಕಡಿಮೆ ಇಮ್ಯುನೊಬ್ಲಾಟ್‌ಗಳನ್ನು ವಿರೋಧಿ PACT ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.b RNA ಪುಲ್-ಡೌನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು HCT116 (ಮೇಲ್ಭಾಗ) ಮತ್ತು HepG2 (ಕೆಳಭಾಗ) ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಇಮ್ಯುನೊಬ್ಲೋಟಿಂಗ್ ಮೂಲಕ PACT ಪುಷ್ಟೀಕರಣವನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಯಿತು.ಸೂಚಿಸಲಾದ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು SW620 ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ cRNA ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಶನ್ (RIP) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.d PACT ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಕರ್ವ್‌ಗಳನ್ನು ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ DARS-AS1 ಅಥವಾ ನಿಯಂತ್ರಣ RNA ಗೆ ಬಯೋಲೇಯರ್ ಇಂಟರ್‌ಫೆರೊಮೆಟ್ರಿ (BLI) ಬಳಸಿ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.ಆರ್ಎನ್ಎಯನ್ನು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ಬಯೋಸೆನ್ಸರ್ನಲ್ಲಿ ನಿಶ್ಚಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಲು 1 μM PACT ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.e RNA ಪುಲ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ DARS-AS1 ಅಥವಾ ಮೊಟಕುಗೊಳಿಸಿದ (ಮೇಲ್ಭಾಗ) ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.PACT ಸ್ವೀಕರಿಸಿದ (ಕೆಳಗೆ) ತೋರಿಸುವ ಇಮ್ಯುನೊಬ್ಲಾಟ್.f ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಫ್ಲ್ಯಾಗ್ ಮಾಡಿದ PACT ಅನ್ನು ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ DARS-AS1 ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗಿದೆ ಅಥವಾ ವಿಟ್ರೊ RIP ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಮೊಟಕುಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ (e ನಲ್ಲಿರುವಂತೆ).ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ RNAಯನ್ನು RT-qPCR ಪರಿಶೀಲಿಸಿದೆ.g PACT ಗಾಗಿ ವಿವಿಧ RNA ತುಣುಕುಗಳ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಬಯೋಲೇಯರ್ ಇಂಟರ್ಫೆರೋಮೆಟ್ರಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, 100 nM RNA ಮತ್ತು 1 μM RAST ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.h ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ RIP ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಅಖಂಡ ಅಥವಾ ಮೊಟಕುಗೊಳಿಸಿದ PACT ಲೇಬಲ್ ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ RNAಯನ್ನು RT-qPCR ಪರಿಶೀಲಿಸಿದೆ.i DARS-AS1, PACT, ಅಥವಾ ಎರಡನ್ನೂ ಅತಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ SW620 ಕೋಶಗಳ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ದರ.j SW620 ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ ಅಥವಾ ಮೊಟಕುಗೊಳಿಸಿದ DARS-AS1 ನ ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡವು ಜೀವಕೋಶದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮೇಲೆ ವಿಭಿನ್ನ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಬೀರಿತು.k ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್ ಅನ್ನು ಆಂಟಿ-PARP ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಇಮ್ಯುನೊಬ್ಲೋಟಿಂಗ್ ಮೂಲಕ ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಯಿತು.l DARS-AS1 ನ ನಾಕೌಟ್ ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿಯಿಂದ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ SW620 ಜೀವಕೋಶಗಳ ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್ ಅನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ.ತೋರಿಸಲಾದ ಡೇಟಾವು ಮೂರು ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಸರಾಸರಿ ± ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವಾಗಿದೆ. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, ಎರಡು-ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ ಪರೀಕ್ಷೆಯಿಂದ. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, ಎರಡು-ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ ಪರೀಕ್ಷೆಯಿಂದ. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 ಎರಡು ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯಿಂದ. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 ಎರಡು ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯಿಂದ.
ನಾವು ನಂತರ PACT ಅಸೋಸಿಯೇಷನ್‌ಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ DARS-AS1 ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಮೂಲಕ ಮೂರು ಬಯೋಟೈನೈಲೇಟೆಡ್ DARS-AS1 RNA ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ರಚಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 3e).ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಪ್ರತಿ ತುಣುಕು PACT ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸಲು ಸಮರ್ಥವಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ, ಆದರೆ 3′-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರದೇಶ (384-768 ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳು A3 ಎಂದು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ) 1-384 ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು A1 ಎಂದು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ (Fig. 3e).ಮರುಸಂಯೋಜಕ PACT (ಚಿತ್ರ 3f) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ RIP ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ.ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, BLI ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಿಶ್ಚಲವಾದ RNA ತುಣುಕುಗಳನ್ನು PACT ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಪ್ರಯೋಗಗಳು PACT A3 (384-768 nt) ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಸರಿಸುಮಾರು 94.6 nM ನ KD ಮೌಲ್ಯ), ಆದರೆ ಇತರ ಪ್ರದೇಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಯಾವುದೇ ಸಂಪರ್ಕಗಳಿಲ್ಲ.(ಚಿತ್ರ 3 ಡಿ).
ನಾವು PACT ನಲ್ಲಿ ಸಂಬಂಧಿತ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಸಹ ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ.PACT ಮೂರು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ, ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಎರಡು ಸಂರಕ್ಷಿತ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳು (ಡಿಎಸ್‌ಆರ್‌ಬಿಡಿ) ಮತ್ತು ಮೂರನೇ ಡೊಮೇನ್ (ಡಿ 3) ಇದು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂವಹನಗಳ ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ ಆಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿ ಡೊಮೇನ್‌ನ lncRNA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ನಾವು ಮೂರು ರೂಪಾಂತರಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಅದು ಪ್ರತಿ ಮೂರು ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ RIP ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ.ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು PACT ಯ ಮೂರನೇ ಡೊಮೇನ್ (D3) ಅಳಿಸುವಿಕೆಯು DARS-AS1 ನೊಂದಿಗೆ ಅದರ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಅಖಂಡ PACT ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ 0.11 ಪಟ್ಟು) ಇತರ ಎರಡು ರೂಪಾಂತರಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ (Fig. 3h), ಇದು ಬಿಡುಗಡೆಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ D3 ನವರು DARS ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸಿದರು.-ಎಸಿ1.ಒಟ್ಟಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು DARS-AS1 ಮತ್ತು PACT ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು ಪ್ರಾಥಮಿಕವಾಗಿ DARS-AS1 ನ 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಮತ್ತು PACT ನ D3 ಡೊಮೇನ್ ಮೂಲಕ ಸಂಭವಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
DARS-AS1 PACT ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಮೇಲೆ ಯಾವುದೇ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು PACT DARS-AS1 (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 3c) ಮೇಲೆ ಯಾವುದೇ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲಿಲ್ಲ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಜೀವಕೋಶದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮೇಲೆ PACT ನಾಕ್‌ಡೌನ್‌ನ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ನಾವು ನಂತರ ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ.DARS-AS1 ಗೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, PACT ಅನ್ನು ಹೊಡೆದುರುಳಿಸಿದಾಗ ಸಂಬಂಧಿತ ಕೋಶಗಳು 1.5-3 ಪಟ್ಟು ವೇಗವಾಗಿ ಬೆಳೆಯುತ್ತವೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 3d).ವಸಾಹತು ರಚನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು PACT (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗ್. 3e) ನೊಂದಿಗೆ shRNA ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ ಜೀವಕೋಶಗಳು 2-3-ಪಟ್ಟು ವಸಾಹತುಗಳನ್ನು ರಚಿಸಿದವು ಎಂದು ಸೂಚಿಸಿತು.PACT ಮೂಲಕ DARS-AS1 ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, PACT, DARS-AS1 ಅಥವಾ ಎರಡನ್ನೂ ಅತಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ SW620 ಕೋಶಗಳನ್ನು ನಾವು ರಚಿಸಿದ್ದೇವೆ.PACT ಯ ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡವು ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣದ ಗಮನಾರ್ಹ ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3i).DARS-AS1 ಮಿತಿಮೀರಿದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ DARS-AS1 ಮತ್ತು PACT ಅನ್ನು ಅತಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಜೀವಕೋಶಗಳ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ದರದಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸವಿಲ್ಲ.DARS-AS1 ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡದಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಹೆಚ್ಚಿದ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು PACT ಪ್ರತಿರೋಧಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.
DARS-AS1 ನ ವಿವಿಧ ಪ್ರದೇಶಗಳು ವಿಭಿನ್ನ PACT-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದರಿಂದ, DARS-AS1 ತುಣುಕುಗಳ ವಿಭಿನ್ನ ಮಿತಿಮೀರಿದ ಮೂಲಕ ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣದ ಮೇಲೆ ಅವುಗಳ ಸಂಬಂಧಿತ ಪ್ರಭಾವವನ್ನು ನಾವು ತನಿಖೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ.ಇತರ ಎರಡು ತುಣುಕುಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, DARS-AS1 ಅನ್ನು 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ (384–768 nt) ಅತಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು DARS-AS1 ನಲ್ಲಿನ ಮುಖ್ಯ PACT-ಸಂಬಂಧಿತ ಪ್ರದೇಶವಾಗಿದೆ, ಇದು ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ (Fig. 3j).ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು DARS-AS1 ನ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯ ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ಕ್ರಿಯೆಯ ನಡುವಿನ ಸಕಾರಾತ್ಮಕ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.
PACT ಪ್ರೊ-ಅಪೊಪ್ಟೋಟಿಕ್ ಪ್ರೋಟೀನ್19 ಎಂದು ವರದಿಯಾಗಿದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್ ಮೇಲೆ DARS-AS1 ನ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ.ನಿರೀಕ್ಷೆಯಂತೆ, DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್ SW620 ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ PARP ಸೀಳನ್ನು ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಿತು ಮತ್ತು SW620, HCT116, HepG2, ಮತ್ತು MBA-MD-231 ಸೆಲ್ ಲೈನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (Fig. 3k) ಅನೆಕ್ಸಿನ್ V-ಪಾಸಿಟಿವ್ ಕೋಶಗಳ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿತು.3)3f-h), ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ DARS-AS1 ನ ಆಂಟಿ-ಅಪೊಪ್ಟೋಟಿಕ್ ಪರಿಣಾಮವು PACT ಯ ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್-ಪ್ರಚೋದಿಸುವ ಕಾರ್ಯಕ್ಕೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಒಟ್ಟಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು DARS-AS1 ಆಂಕೊಜೆನಿಕ್ ಕ್ರಿಯೆಯ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವು PACT ಕ್ರಿಯೆಯ ಪ್ರತಿಬಂಧದ ಮೂಲಕ ಆಗಿರಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಮುಂದೆ, ನಾವು DARS-AS1-PACT ಅಸೋಸಿಯೇಷನ್‌ನ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಅನ್ವೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ.PACT ನೇರ ಸಂವಾದದ ಮೂಲಕ PKR ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ವರದಿಯಾಗಿದೆ, ಇದು ತರುವಾಯ eIF2α ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಭಾಷಾಂತರ ಅಳಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್ಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.ಮೊದಲಿಗೆ, PACT ಮತ್ತು PKR ನ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಸ್ಥಳೀಕರಣದ ಮೇಲೆ DARS-AS1 ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆಯೇ ಎಂದು ನಾವು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ.0.72 ರ ಸರಾಸರಿ ಪಿಯರ್ಸನ್ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧದ ಗುಣಾಂಕದೊಂದಿಗೆ SW620 ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ PACT ಮತ್ತು PKR ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಕೋಲೋಕಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ತೋರಿಸಿದೆ.ಏತನ್ಮಧ್ಯೆ, DARS-AS1 ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡವು PACT ಮತ್ತು PKR ಸಹ-ಸ್ಥಳೀಕರಣವನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿತು (ಅಂದರೆ ಪಿಯರ್ಸನ್ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಗುಣಾಂಕ 0.61) (ಚಿತ್ರ 4a).DARS-AS1 PACT-PKR ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಮಾಡ್ಯುಲೇಟ್ ಮಾಡಬಹುದೇ ಎಂದು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು, ನಾವು SW620 ಸೆಲ್ ಲೈಸೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಆಂಟಿ-PACT ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಸಹ-ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಶನ್ (ಸಹ-IP) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ.PKR ನಿಯಂತ್ರಣ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ವಿರೋಧಿ PACT ಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿದೆ, ಆದರೆ PKR ಚೇತರಿಕೆಯು DARS-AS1 (Fig. 4b) ಅನ್ನು ಅತಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಜೀವಕೋಶಗಳಿಂದ ಲೈಸೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ.ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ PACT ಮತ್ತು PKR ಅನ್ನು ವಿಟ್ರೊ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅಸ್ಸೇಸ್‌ಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಅಂತೆಯೇ, DARS-AS1 ಅನ್ನು ಒದಗಿಸಿದ ಆದರೆ ಯಾವುದೇ ನಿಯಂತ್ರಣ RNA ದಮನಿತ PACT-PKR ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 4c).DARS-AS1 PACT ಮತ್ತು PKR ಸಂವಹನವನ್ನು ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಿದೆ ಎಂದು ಎಲ್ಲಾ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ತೋರಿಸಿವೆ.
ನಿಯಂತ್ರಣ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ PACT ಮತ್ತು PKR ನ ಸಹ-ಸ್ಥಳೀಕರಣ ಅಥವಾ DARS-AS1 ಅನ್ನು ಅತಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಬಳಸಿ ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ.ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳನ್ನು DAPI ಯೊಂದಿಗೆ ಬಣ್ಣಿಸಲಾಗಿದೆ.16 ಛಾಯಾಚಿತ್ರಗಳಿಂದ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.b ಕಂಟ್ರೋಲ್ SW620 ಕೋಶಗಳ ಸೆಲ್ ಲೈಸೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಆಂಟಿ-PACT ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಹ-ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಶನ್ (ಸಹ-IP) ಅಥವಾ DARS-AS1 ಅನ್ನು ಅತಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಜೀವಕೋಶಗಳು.ಸಿ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ PACT, ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ PKR ಮತ್ತು DARS-AS1 ಅಥವಾ ಅಣಕು RNA ಯೊಂದಿಗೆ ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ಲಿಪ್ಯಂತರ ಮಾಡಲಾದ ವಿಟ್ರೊ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗಿದೆ.ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಶನ್‌ಗಾಗಿ ಆಂಟಿ-ಫ್ಲ್ಯಾಗ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.d ಸೂಚಿಸಿದ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಇಮ್ಯುನೊಬ್ಲಾಟ್‌ಗಳನ್ನು SW620 ಮತ್ತು HCT116 ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ನಿಯಂತ್ರಣ shRNA ಅಥವಾ DARS-AS1-shRNA ಯೊಂದಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಸೀರಮ್ ಹಸಿವು.e DARS-AS1 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟಗಳು ಟ್ಯಾಪ್ಸಿಗಾರ್ಜಿನ್‌ಗೆ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಸಂವೇದನೆಯನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಿದವು.SW620 ಕೋಶಗಳನ್ನು DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 ಓವರ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ರೆಶನ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಅಥವಾ ಕಂಟ್ರೋಲ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು.ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಟ್ಯಾಪ್ಸಿಗಾರ್ಗಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ 48 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು MTS ಕಾರಕವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಜೀವಕೋಶದ ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು.f ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೆಡ್ DARS-AS1 ಅಥವಾ ಡಮ್ಮಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ PACT ಅನ್ನು ವಿಟ್ರೊ ಆಕ್ಟಿವೇಶನ್ ಅಸ್ಸೇ ಮತ್ತು ಇಮ್ಯುನೊಬ್ಲಾಟ್ ಪತ್ತೆಗೆ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.g ಈ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಇಮ್ಯುನೊಬ್ಲಾಟ್‌ಗಳನ್ನು SW620-ctrl ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ (ಎಡ) ಅಥವಾ PKR ರೂಪಾಂತರಿತ ಕೋಶಗಳ ಮೇಲೆ (ಬಲ) ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಈ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ನಂತರ ನಿಯಂತ್ರಣ shRNA ಅಥವಾ DARS-AS1-shRNA ಯೊಂದಿಗೆ ಸೀರಮ್ ಹಸಿವಿನಿಂದ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು.h ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿಯು ರೂಪಾಂತರಿತ PKR ನ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯು SW620 ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ DARS-AS1-ಪ್ರೇರಿತ ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್‌ಗೆ ಸರಿದೂಗಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ.i ಸೂಚಿಸಿದ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಇಮ್ಯುನೊಬ್ಲಾಟ್‌ಗಳನ್ನು SW620 (ಎಡ) ಅಥವಾ HCT116 (ಬಲ) ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ನಿಯಂತ್ರಣ shRNA ಅಥವಾ DARS-AS1 shRNA ಯೊಂದಿಗೆ ವರ್ಗಾವಣೆಗೊಂಡ ಜೀವಕೋಶಗಳು ಸೀರಮ್-ವಂಚಿತವಾಗಿವೆ ಮತ್ತು 100 nM PKR C16 ಪ್ರತಿರೋಧಕ ಅಥವಾ DMSO ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ.ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ = 5 µm.ತೋರಿಸಲಾದ ಡೇಟಾವು ಮೂರು ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಸರಾಸರಿ ± ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವಾಗಿದೆ.* p ≤ 0.05 ಎರಡು-ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆ.
ಒಮ್ಮೆ PACT PKR17 ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸಿದರೆ, Thr451 ನಲ್ಲಿ PKR ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ನಂಬಲಾಗಿದೆ.ಸೀರಮ್ ಹಸಿವಿನ ನಂತರ DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ PKR ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸೂಚಿಸಿವೆ (Fig. 4d ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4a).ಅಂತೆಯೇ, DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4a) ಯಿಂದ eIF2α, ಮುಖ್ಯ PKR ತಲಾಧಾರದ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಸಹ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ.ಥಾಪ್ಸಿಗಾರ್ಗಿನ್ ಒಂದು ಇಆರ್ ಸ್ಟ್ರೆಸರ್ ಆಗಿದ್ದು ಅದು ER Ca2+ ಅನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.ಟ್ಯಾಪ್ಸಿಗಾರ್ಗಿನ್‌ನೊಂದಿಗಿನ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು PACT ಯ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮತ್ತು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ವರದಿಯಾಗಿದೆ, ಇದು PKR ನೊಂದಿಗೆ ಮತ್ತಷ್ಟು ಸಂವಹಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ, eIF2α ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ 18,61 ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವ ಮೂಲಕ ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.ಇಲ್ಲಿ, PACT/PKR ಮಾರ್ಗವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುವ ಮೂಲಕ DARS-AS1 ಜೀವಕೋಶಗಳು ಒತ್ತಡವನ್ನು ಜಯಿಸಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡಬಹುದೇ ಎಂದು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು PACT/PKR ಮಾರ್ಗದ ಉತ್ತೇಜಕವಾಗಿ ನಾವು ಟ್ಯಾಪ್ಸಿಗಾರ್ಜಿನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ.DARS-AS1 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಮಟ್ಟವು ಟ್ಯಾಪ್ಸಿಗಾರ್ಗಿನ್‌ಗೆ ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರತಿರೋಧದೊಂದಿಗೆ ಧನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ.DARS-AS1 ಅನ್ನು ಅತಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ SW620 ಕೋಶಗಳು ಟ್ಯಾಪ್ಸಿಗಾರ್ಜಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಿದಾಗ ಉತ್ತಮವಾಗಿ ಉಳಿದುಕೊಂಡಿವೆ, ಆದರೆ DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಹೊಂದಿರುವ ಕೋಶಗಳು ಹೆಚ್ಚು ಒಳಗಾಗುತ್ತವೆ (Fig. 4e).ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, DARS-AS1 ಮಿತಿಮೀರಿದ ಒತ್ತಡವು ಟ್ಯಾಪ್ಸಿಗಾರ್ಜಿನ್-ಪ್ರೇರಿತ PKR ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4b).ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ಟ್ಯಾಪ್ಸಿಗಾರ್ಗಿನ್ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ, ನಿಯಂತ್ರಣ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ PKR ಮತ್ತು eIF2α ಅನ್ನು DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ (ಪೂರಕ Fig. 4b).ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಟ್ಯಾಪ್ಸಿಗಾರ್ಜಿನ್ DARS-AS1 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಡೋಸ್-ಅವಲಂಬಿತ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೇರೇಪಿಸಿತು, ಇದು DARS-AS1 ನ ಒತ್ತಡ-ವಿರೋಧಿ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4c).ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಈ ಅವಲೋಕನಗಳನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸಲು ನಾವು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಆಕ್ಟಿವೇಶನ್ ಅಸ್ಸೇಗಳನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ.ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, PKR ಅನ್ನು PKR ವಿರೋಧಿ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸೆಲ್ ಲೈಸೇಟ್‌ಗಳಿಂದ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಮರುಸಂಯೋಜಕ PACT ಮತ್ತು DARS-AS1 ನೊಂದಿಗೆ ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ಲಿಪ್ಯಂತರಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಂತರ, WB ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಫಾಸ್ಫೋ-ಪಿಕೆಆರ್ ಅನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಯಿತು.PKR ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಅನ್ನು DARS-AS1 ನಿಂದ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸೂಚಿಸಿವೆ, ಆದರೆ ನಿಯಂತ್ರಣ RNA ಯಿಂದ ಅಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 4f).ಈ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಮತ್ತು ವಿವೋ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು DARS-AS1 PACT-ಮಧ್ಯಸ್ಥ PKR ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, DARS-AS1 (ಚಿತ್ರ 4f) ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ PACT ಚೇತರಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಇಳಿಕೆಯನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಈ ಫಲಿತಾಂಶವು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅಸೇ (ಚಿತ್ರ 4c) ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು PACT-PKR ಅಸೋಸಿಯೇಷನ್‌ಗಾಗಿ DARS-AS1 ನ ತಡೆಯುವ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಮತ್ತೊಮ್ಮೆ ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ.
ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಒತ್ತಡದಲ್ಲಿ PKR ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಗಾಗಿ PACT ನ D3 ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿ Ser246 ಮತ್ತು Ser287 ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಅಲನೈನ್‌ಗೆ ಎರಡು ಸೆರೈನ್ ಅವಶೇಷಗಳ ಪರ್ಯಾಯವು ರೂಪಾಂತರಿತ PACT (mutD) ಅನ್ನು ನೀಡಿತು, ಇದು ಒತ್ತಡದ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ PKR ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿತು ಮತ್ತು ಅಲನೈನ್ (ಮ್ಯುಟಾ) ಗೆ ಪರ್ಯಾಯವಾಗಿ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಅನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಿತು.DARS-AS1 ನೊಂದಿಗೆ ನೇರ ಸಂಬಂಧದಲ್ಲಿ ನಾವು ಈ ಡೊಮೇನ್‌ನ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಿರುವುದರಿಂದ, ಈ ಅವಶೇಷಗಳು DARS-AS1 ನೊಂದಿಗೆ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಳ್ಳಬಹುದೇ ಎಂದು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ನಾವು ಈ ಎರಡು PACT ರೂಪಾಂತರಿತ ರೂಪಗಳನ್ನು ರಚಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಎರಡೂ ರೂಪಾಂತರಿತ ರೂಪಗಳು DARS-AS1 (ಪೂರಕ Fig. 4d) ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಕಳೆದುಕೊಂಡಿವೆ, DARS-AS1 ನೊಂದಿಗೆ ದಕ್ಷ ಸಂವಹನಕ್ಕಾಗಿ PACT ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಸಂಪೂರ್ಣ ರಚನೆಯು ಅಗತ್ಯವಾಗಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಇದಲ್ಲದೆ, ಪ್ರಬಲವಾದ ಋಣಾತ್ಮಕ PACT ರೂಪಾಂತರಿತ (PACTmutA) ಅಥವಾ ಪ್ರಬಲವಾದ ಋಣಾತ್ಮಕ PKR ರೂಪಾಂತರಿತ (PKRmut) (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗರ್. 4e. e) ಅನ್ನು ಅತಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಮೂಲಕ DARS-AS1-shRNA- ಪ್ರೇರಿತ ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣದ ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ಭಾಗಶಃ ಪುನಃಸ್ಥಾಪಿಸಬಹುದು ಎಂದು ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.ಪ್ರಾಬಲ್ಯ-ಋಣಾತ್ಮಕ PKR ಮ್ಯಟೆಂಟ್‌ಗಳ ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡವು DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್‌ನಿಂದ ಪ್ರೇರಿತವಾದ PKR ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಮತ್ತು ಸೀರಮ್-ವಂಚಿತ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ eIF2α ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ (Fig. 4g).ಹೆಚ್ಚು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್‌ನಿಂದ ಪ್ರೇರಿತವಾದ ಅಪೊಪ್ಟೋಟಿಕ್ ಕೋಶಗಳ ಪ್ರಮಾಣವು PKRmut ಅನ್ನು ಅತಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ (Fig. 4h ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4g).PKR ಕೈನೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪ್ರತಿಬಂಧವು DARS-AS1 ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಕುಂಠಿತಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ, ಫಲಿತಾಂಶಗಳು DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಅಪರೂಪವಾಗಿ PKR-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ C16 ಪ್ರತಿರೋಧಕದೊಂದಿಗೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದಾಗ PKR ಮತ್ತು eIF2α ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (Fig. 4i ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4h).)ಒಟ್ಟಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, PACT-ಮಧ್ಯಸ್ಥ PKR ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುವ ಮೂಲಕ DARS-AS1 ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.
ಟ್ಯೂಮೊರಿಜೆನೆಸಿಸ್‌ನಲ್ಲಿ DARS-AS1 ನ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಅನ್ವೇಷಿಸಲು, ನಾವು ಮೌಸ್ ಕ್ಸೆನೋಗ್ರಾಫ್ಟ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು vivo ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ. DARS-AS1 ನ ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಗೆಡ್ಡೆಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ನಾಟಕೀಯವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿದೆ ಎಂದು ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ (p ಮೌಲ್ಯ <0.0001) (Fig. 5a). DARS-AS1 ನ ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಗೆಡ್ಡೆಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ನಾಟಕೀಯವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿದೆ ಎಂದು ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ (p ಮೌಲ್ಯ <0.0001) (Fig. 5a). ರೆಝುಲ್ಟಾಟಿ ಪೋಕಝೈವಟ್, ಚುಕ್ಟೋ ನೋಕ್ಡೌನ್ DARS-AS1 ರೆಸ್ಕೊ ಸ್ನಿಜಾಯೆಟ್ ರೋಸ್ಟ್ ಒಪುಹೋಲಿ ಯು ಮೈಷೇಯ್ (ನಾಮಾಂಕಿತ ಪು <0,0001) ಫಲಿತಾಂಶಗಳು DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿನ ಗೆಡ್ಡೆಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ತೀವ್ರವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ (p ಮೌಲ್ಯ <0.0001) (ಚಿತ್ರ 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001））结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 ರೆಝುಲ್ಟಾಟ್ ಪೊಕಸಾಲಿ, ಚುಕ್ಟೋ ನೋಕ್ಡೌನ್ DARS-AS1 ಜನಚಿಟೆಲ್ನೋ ಸ್ನಿಜಾಯೆಟ್ ರೋಸ್ಟ್ ಒಪುಹೋಲಿ ಯು ಮಿಶೇಯ್ (ನಾಮಾಂಕಿತ ರು <0,00). ಫಲಿತಾಂಶಗಳು DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿನ ಗೆಡ್ಡೆಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (p ಮೌಲ್ಯ <0.0001) (ಚಿತ್ರ 5a).ಹೀಗಾಗಿ, DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿ, ಸರಾಸರಿ ಗೆಡ್ಡೆಯ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಸುಮಾರು 72.9% ರಷ್ಟು ಮತ್ತು ಸರಾಸರಿ ಗೆಡ್ಡೆಯ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿಯು ಸುಮಾರು 87.8% ರಷ್ಟು ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5b-d).ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು DARS-AS1 vivo ನಲ್ಲಿ ಗೆಡ್ಡೆಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಬಲವಾಗಿ ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ನಗ್ನ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿನ ಕೊಲೊರೆಕ್ಟಲ್ ಆಂಕೊಜೆನೆಸಿಸ್ ಮೇಲೆ ಜಾಹೀರಾತು DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್‌ನ ಪರಿಣಾಮಗಳು.ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳು (ಎ), ಗೆಡ್ಡೆಯ ಗಾತ್ರ (ಬಿ), ತೂಕ (ಸಿ), ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಚಿತ್ರಗಳು (ಡಿ) ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ದೋಷ ಪಟ್ಟಿಗಳು ± SEM ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ. n = 10. ****p <0.0001, ಎರಡು-ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ ಪರೀಕ್ಷೆಯಿಂದ. n = 10. ****p <0.0001, ಎರಡು-ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ ಪರೀಕ್ಷೆಯಿಂದ. n = 10. ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p <0.0001 ಎರಡು-ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆ.n = 10. ****p <0.0001,通过双尾学生t 检验。 ****p <0.0001,通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p <0.0001 ಎರಡು-ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆ.e Kaplan-Meier DARS-AS1 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟಗಳು ಮತ್ತು UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM ಮತ್ತು LGG ರೋಗಿಗಳಲ್ಲಿ ಒಟ್ಟಾರೆ ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆಯ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದಾರೆ.ರೋಗಿಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದ DARS-AS1 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ಅಗ್ರ 50% ರಲ್ಲಿದೆ;ರೋಗಿಗಳಲ್ಲಿ DARS-AS1 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಕಡಿಮೆ ಮಟ್ಟವು ಕೆಳಭಾಗದಲ್ಲಿ 50% ಆಗಿತ್ತು.ಲಾಗ್ ಶ್ರೇಣಿಯ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು p-ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.f ಪ್ರಸ್ತಾವಿತ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ DARS-AS1 PACT-PKR ಮಾರ್ಗ ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ.
DARS-AS1 ನ ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಚೆನ್ನಾಗಿ ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು ಅದರ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮತ್ತು ರೋಗಿಯ ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆಯ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ.TCGA ಡೇಟಾಸೆಟ್ ಅನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸುವ ಮೂಲಕ, ಹೆಚ್ಚಿನ DARS-AS1 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ಯುವಿಲ್ ಮೆಲನೋಮ (UVM), ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಕ್ರೋಮೋಫೋಬಿಯಾ (KICH), ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಪ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ಸೆಲ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (KIRP), ಮೆಸೊಥೆಲಿಯೊಮಾ (MESO), ಮಲ್ಟಿಪ್ಲೆಕ್ಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ.ಕಡಿಮೆ ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆಯು ಗ್ಲಿಯೊಬ್ಲಾಸ್ಟೊಮಾ ಮಾರ್ಫೋಸಿಸ್ (GBM) ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ-ದರ್ಜೆಯ ಮೆದುಳಿನ ಗ್ಲಿಯೊಮಾ (LGG) ರೋಗಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5e).ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು DARS-AS1 ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಟ್ಯೂಮರ್ ಪ್ರಗತಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವನ್ನು ವಹಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಬಹು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಭಾವ್ಯ ಮುನ್ಸೂಚಕ ಬಯೋಮಾರ್ಕರ್ ಆಗಿರಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದ CRISPRi ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, DARS-AS1 lncRNA ಎರಡು ಪ್ರಮುಖ ಒತ್ತಡ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶದ ಒತ್ತಡವನ್ನು ನಿವಾರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ, PACT ಮತ್ತು PKR.PACT ನೊಂದಿಗೆ ನೇರವಾಗಿ ಸಂವಹನ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ, DARS-AS1 PACT-ಮಧ್ಯಸ್ಥ PKR ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಅಪೊಪ್ಟೋಟಿಕ್ ಜೀವಕೋಶದ ಮರಣವನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ (Fig. 5f).DARS-AS1 ನ ಉನ್ನತೀಕರಣವನ್ನು ಅನೇಕ ವಿಧದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ, ಒತ್ತಡದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳ ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಅದರ ಕಾರ್ಯವು ಬಹು ವಿಧದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ಗಳಿಗೆ ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಅನ್ವಯಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
PACT ಅನ್ನು PKR ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಎಂದು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು PACT-ಮಧ್ಯಸ್ಥ PKR ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯು ಪ್ರತಿಲೇಖನ, ಅನುವಾದ, ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್ ಮತ್ತು ಇತರ ಪ್ರಮುಖ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಒತ್ತಡದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವನ್ನು ವಹಿಸುತ್ತದೆ.ದಶಕಗಳಿಂದ, PACT-PKR ಕ್ಯಾಸ್ಕೇಡ್‌ನ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಪ್ರಯತ್ನಗಳನ್ನು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಇಲ್ಲಿ, ನಮ್ಮ ಅಧ್ಯಯನವು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ lncRNA DARS-AS1 ಮೂಲಕ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ PACT-PKR ನಿಯಂತ್ರಣದ ವಿಭಿನ್ನ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದೆ, ಇದು ನೇರವಾಗಿ PACT ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, PACT-PKR ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, PKR ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು eIF2α ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಒತ್ತಡ-ಪ್ರೇರಿತ ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್ ಮತ್ತು ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ. ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ.ಜೀವಕೋಶಗಳು.ಈ ಆವಿಷ್ಕಾರವು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಮುನ್ನರಿವು ಮತ್ತು ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಾಗಿ ಸಂಭಾವ್ಯ lncRNA ಗುರಿಗಳ ಮೇಲೆ ಬೆಳಕು ಚೆಲ್ಲುತ್ತದೆ.
ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟೆಡ್ PKR ಮತ್ತು eIF2α ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಹೆಚ್ಚಳದೊಂದಿಗೆ DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸೀರಮ್ ಹಸಿವಿನಿಂದ ಸಂವೇದನಾಶೀಲಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಮ್ಮ ಡೇಟಾ ತೋರಿಸಿದೆ.PACT/PKR ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುವ ಮೂಲಕ ಕಠಿಣ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ DARS-AS1 ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಜೀವಕೋಶದ ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.ASPACT ಮತ್ತು nc886 ನಂತಹ ಹಲವಾರು ಇತರ ಕೋಡಿಂಗ್-ಅಲ್ಲದ RNAಗಳು PACT48 mRNA ಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಅಥವಾ PKR49,50,64 ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಮೂಲಕ ಆಟೋಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಮೂಲಕ PACT/PKR ಅಕ್ಷದಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಕೊಂಡಿವೆ.ಅವುಗಳಲ್ಲಿ, DARS-AS1 PACT-PKR ಅಸೋಸಿಯೇಷನ್‌ನ ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸುವಂತೆ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ.ಈ ಅಧ್ಯಯನವು PACT/PKR ಅಕ್ಷದ ನಿಯಂತ್ರಣ ಮತ್ತು ಒತ್ತಡದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ lncRNA ಗಳ ಪಾತ್ರದ ಬಗ್ಗೆ ನಮ್ಮ ತಿಳುವಳಿಕೆಯನ್ನು ಉತ್ಕೃಷ್ಟಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.
PACT ಮೂರು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ.ಮೊದಲ ಎರಡು ಡಿಎಸ್‌ಆರ್‌ಬಿಡಿಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ ಪಿಎಸಿಟಿಯನ್ನು ಪಿಕೆಆರ್‌ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಫಿನಿಟಿ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಾಧಿಸಲು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಮೂರನೇ ಡೊಮೇನ್ (ಡಿ3) ವಿಟ್ರೊ ಮತ್ತು ವಿವೊದಲ್ಲಿ ಪಿಕೆಆರ್ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ನಮ್ಮ ಅಧ್ಯಯನವು DARS-AS1 ಪ್ರಾಶಸ್ತ್ಯವಾಗಿ D3 ಡೊಮೇನ್ (Fig. 3h) ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ.ದೊಡ್ಡ ಗಾತ್ರದ lncRNA (768 ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳು), D3 ಗೆ DARS-AS1 ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯು dsRBD ಮತ್ತು PKR ನ PACT ಡೊಮೇನ್ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ದೈಹಿಕವಾಗಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ PACT ಮತ್ತು PKR ನ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ.PACT ಪಾಯಿಂಟ್ ಮ್ಯುಟೇಶನ್‌ಗಳು Ser246 ಮತ್ತು Ser287 ಅನ್ನು D3 ನಲ್ಲಿ ಅಲನೈನ್ ಅಥವಾ ಆಸ್ಪರ್ಟೇಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಿದವು DARS-AS1 ಗೆ ಅದರ ಬಂಧಕ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಿದವು, D3 ನ ಒಟ್ಟಾರೆ ರಚನಾತ್ಮಕ ಮತ್ತು ವಿದ್ಯುತ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಅವುಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯಲ್ಲಿ ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.ಹೆಚ್ಚು ನಿಖರವಾದ ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ PACT ರಚನಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಈ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದ ಹೆಚ್ಚಿನ ವಿವರಗಳು ಭವಿಷ್ಯದಲ್ಲಿ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ.
ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು DARS-AS1 ಹಲವಾರು ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಮೂಲಕ ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ವರದಿ ಮಾಡಿದೆ 51,52,53.ಒಂದು ಉದಾಹರಣೆಯಲ್ಲಿ, DARS-AS1 ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ miP-194-5p ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸುವ ಮೂಲಕ ಅದರ ಆಂಟಿಸೆನ್ಸ್ ಪ್ರೊಟೀನ್-ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ DARS ಜೀನ್ ಅನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತನಿಖಾಧಿಕಾರಿಗಳು ಗಮನಿಸಿದರು.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಪ್ರಸ್ತುತ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, DARS-AS1 ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಕನಿಷ್ಠ ಕೊಲೊರೆಕ್ಟಲ್, ಸ್ತನ ಮತ್ತು ಯಕೃತ್ತಿನ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಸೇರಿದಂತೆ ಬಹು ವಿಧದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ DARS ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಮೇಲೆ ಕಡಿಮೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಿತು.ಎಲ್‌ಎನ್‌ಸಿಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗಳು ಕೋಶ ಮತ್ತು ಅಂಗಾಂಶ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುವುದರಿಂದ, ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಪ್ರಕಾರಗಳಲ್ಲಿ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಸಂರಕ್ಷಿಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ, ಇದು ನಮ್ಮ ಅವಲೋಕನಗಳು ಮತ್ತು ವಿಭಿನ್ನ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ಗಳ ಹಿಂದಿನ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನಗಳ ನಡುವಿನ ಈ ವ್ಯತ್ಯಾಸಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು.ವಿವಿಧ ಶಾರೀರಿಕ ಮತ್ತು ರೋಗಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟಪಡಿಸಲು ವಿಶೇಷ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಅಗತ್ಯವಿದೆ.
ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಡೇಟಾದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿನ DARS-AS1 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ರೋಗಿಗಳ ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ವಿಲೋಮ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ, ಇದು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಮುನ್ನರಿವಿನಲ್ಲಿ DARS-AS1/PACT/PKR ಅಕ್ಷದ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಒತ್ತಿಹೇಳುತ್ತದೆ.ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ, ನಮ್ಮ ಅಧ್ಯಯನವು DARS-AS1 PACT/PKR ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಅಕ್ಷದ ನಿಯಂತ್ರಕವಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಒತ್ತಡದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಮತ್ತೊಂದು ಸಂಶೋಧನೆಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಂಭಾವ್ಯ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳ ಭವಿಷ್ಯದ ಸಂಶೋಧನೆಗೆ ಆಸಕ್ತಿಯನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ. .
ಹ್ಯೂಮನ್ ಸೆಲ್ ಲೈನ್‌ಗಳು SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ಮತ್ತು HEK293T ಅನ್ನು ಚೀನಾದಲ್ಲಿನ ರಾಷ್ಟ್ರೀಯ ಸೆಲ್ ಲೈನ್ ಸಂಪನ್ಮೂಲ ಮೂಲಸೌಕರ್ಯದಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.ಎಲ್ಲಾ ಕೋಶಗಳನ್ನು DMEM ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ (DMEM, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ವಾಲ್ಥಮ್, MA) 10% FBS (ಜೆಮಿನಿ, ಬ್ರೂಕ್ಲಿನ್, NY) ಮತ್ತು 1% ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್-ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) 37 ° C, 5% CO2 ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗಿದೆ.ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟರ್.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);ವಿರೋಧಿ PKR, Abcam (ab184257);ವಿರೋಧಿ PKR (ಫಾಸ್ಫೋ-T451), ಅಬ್ಕ್ಯಾಮ್ (ab81303);ವಿರೋಧಿ ಧ್ವಜ, ಅಬ್ಕ್ಯಾಮ್ (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764)) ;ವಿರೋಧಿ eIF2α (ಫಾಸ್ಫರಸ್ S51), ಅಬ್ಕ್ಯಾಮ್ (ab32157);ವಿರೋಧಿ PACT (ಫಾಸ್ಫರಸ್ S246), ಅಬ್ಜೆಂಟ್ (AP7744b);ವಿರೋಧಿ β-tubulin, CST (2128);ಸಾಮಾನ್ಯ ಮೌಸ್ IgG, CST (5415S);ಸಾಮಾನ್ಯ ಮೊಲ IgG, CST (2729S).ಪಾಶ್ಚಾತ್ಯ ಬ್ಲಾಟಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ PBST ಯಲ್ಲಿ 1:1000 ಮತ್ತು IP ಗಾಗಿ 1:100 ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.
CRISPR-ERA66 ಎಂಬ ಸಾರ್ವಜನಿಕವಾಗಿ ಲಭ್ಯವಿರುವ ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು sgRNA ಗಳನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ನಾವು sgRNA ಅಭಿವೃದ್ಧಿಗಾಗಿ ಡೀಫಾಲ್ಟ್ ಟೂಲ್ ಪ್ಯಾರಾಮೀಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು 3 kb ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್ ಕಂಪ್ಯೂಟೆಡ್ sgRNA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ.TSS ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರೀಕೃತವಾಗಿದೆ.sgRNA ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್‌ಗಳ ಪೂಲ್‌ಗಳನ್ನು CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) ನಲ್ಲಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಮಾನವೀಕರಿಸಿದ pgRNA ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ಗಳಾಗಿ ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ (Addgene #44248).ಒಟ್ಟು 12 µg ಪೂಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಮಾನವೀಕರಿಸಿದ pgRNA ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್, 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260), ಮತ್ತು 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) 5 x 1036 ಸೆಂಟಿಮೀಟರ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫೆಕ್ಶನ್ ಡಿಎನ್‌ಎಗೆ ವರ್ಗಾವಣೆಗೊಂಡ 5 x 1036 ಸೆಂಟಿಮೀಟರ್ ಡಿಎನ್‌ಎಗೆ ವರ್ಗಾವಣೆಗೊಂಡಿತು. ಕೋಶಗಳು (CWBIO, ಬೀಜಿಂಗ್, ಚೀನಾ) ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ.ವರ್ಗಾವಣೆಯಾದ 48 ಮತ್ತು 72 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ವೈರಸ್-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 0.45 µm ಫಿಲ್ಟರ್ ಮೂಲಕ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ, dCas9/KRAB ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ SW620 ಕೋಶಗಳನ್ನು ವೈರಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡಕ್ಷನ್ ಮೂಲಕ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.0.1-0.3 ರ MOI ನಲ್ಲಿ ನಾಲ್ಕು ಸ್ವತಂತ್ರ ಸೋಂಕಿನ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ SW620 ಕೋಶಗಳು ವೈರಸ್ ಲೈಬ್ರರಿಯಿಂದ ಸೋಂಕಿಗೆ ಒಳಗಾಗಿದ್ದವು ಮತ್ತು 2 ದಿನಗಳವರೆಗೆ 2 μg/ml puromycin (ಸಿಗ್ಮಾ, ಸೇಂಟ್ ಲೂಯಿಸ್, MO) ನೊಂದಿಗೆ ಸ್ಯಾಂಪಲ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು.ಅದರ ನಂತರ, 500 ಜೀವಕೋಶಗಳು/sgRNA ಯ ಕನಿಷ್ಠ ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯೊಂದಿಗೆ 18 ದಿನಗಳ ಕಾಲ ಕೋಶಗಳನ್ನು ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ಕಲ್ಚರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು.
QIAamp DNA ಬ್ಲಡ್ ಮಿಡಿ ಕಿಟ್ (QIAGEN, Düsseldorf, ಜರ್ಮನಿ; 51183) ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ಅನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಗಿದೆ.ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ನಿರ್ಮಿಸಲು ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗೆ 100 μg ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.sgRNA ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಪಿಸಿಆರ್‌ನ ಎರಡು ಸುತ್ತುಗಳಿಂದ ವರ್ಧಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಬಾರ್‌ಕೋಡ್‌ಗೆ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
PCR ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು NucleoSpin® ಜೆಲ್ ಮತ್ತು PCR ಶುದ್ಧೀಕರಣ ಕಿಟ್ (MACHEREY-NAGEL, Düren, ಜರ್ಮನಿ; 740609.250) ಬಳಸಿ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು Qubit™ HS ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ DNA ಪತ್ತೆ ಕಿಟ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್; Q32854) ಬಳಸಿ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಅಳೆಯಲು MTS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.2000 ಜೀವಕೋಶಗಳು/ಬಾವಿಯ ಆರಂಭಿಕ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ 96-ಬಾವಿ ಫಲಕಗಳಲ್ಲಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಬಿತ್ತಲಾಗಿದೆ.ಒಟ್ಟು 4-6 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಸೂಚಿಸಲಾದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕೋಶಗಳ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿದಿನ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ, 20 μl MTS ಕಾರಕವನ್ನು (ಪ್ರೊಮೆಗಾ) 100 μl DMEM ನೊಂದಿಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, 37 ° C ನಲ್ಲಿ 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಜೀವಕೋಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ OD490 ಅನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಗೋಳಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸುವ ಮೂಲಕ ಆಧಾರರಹಿತ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಯಿತು.ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, shRNA DARS-AS1 ಅಥವಾ ಕಂಟ್ರೋಲ್ shRNA ಯೊಂದಿಗೆ ವರ್ಗಾವಣೆಗೊಂಡ 2000 ಕೋಶಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿ 4 ದಿನಗಳಿಗೊಮ್ಮೆ ಮಧ್ಯಮ ಬದಲಾವಣೆಯೊಂದಿಗೆ ಅಲ್ಟ್ರಾ ಕಡಿಮೆ ಲಗತ್ತು ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (ಕಾರ್ನಿಂಗ್) ಬೆಳೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ.14 ದಿನಗಳ ನಂತರ ಗೋಳಗಳನ್ನು ಎಣಿಸಲಾಗಿದೆ.DARS-AS1 ಓವರ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ರೆಶನ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಅಥವಾ ಕಂಟ್ರೋಲ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ ವರ್ಗಾವಣೆಗೊಂಡ 500 ಕೋಶಗಳನ್ನು ವರ್ಧನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ, ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ ವಿಧಾನವು ಬದಲಾಗದೆ ಉಳಿದಿದೆ.
ರೈಬೋಪ್ರೊಬ್ ಕಾಂಬಿನೇಶನ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್ (ಪ್ರೊಮೆಗಾ P1440) ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ T7 RNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಮತ್ತು ಬಯೋಟಿನ್-16-UTP (ರೋಚೆ 1138908910) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು RNA ಅನ್ನು ಲಿಪ್ಯಂತರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಇಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 4 ರಲ್ಲಿ ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
ಪ್ರೊಟೀನ್-ಕೋಡಿಂಗ್ PACT ಅಥವಾ PKR ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು pET15b (Addgene #73619) ಆಗಿ ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು BL21 (DE3) ಆಗಿ ರೂಪಾಂತರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಆಂಪಿಸಿಲಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಒದಗಿಸಲಾದ ಎಲ್‌ಬಿಯಲ್ಲಿ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ತಾಜಾ ಎಲ್‌ಬಿಯೊಂದಿಗೆ 100 ಪಟ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಮಾಧ್ಯಮದ OD600 0.8 ತಲುಪಿದಾಗ, ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸಲು 1 mM IPTG ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.ಸೌಮ್ಯವಾದ ಅಲುಗಾಡುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ರಾತ್ರಿಯ ಕಾವು ನಂತರ (20 ° C ನಲ್ಲಿ 250 rpm), ಸೆಲ್ ಗುಳಿಗೆಯನ್ನು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ (4000 rpm, 10 ನಿಮಿಷ, 4 ° C) ಮೂಲಕ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಲಿಸಿಸ್ ಬಫರ್ (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ನಲ್ಲಿ ಸೆಲ್ ಪೆಲೆಟ್ ಅನ್ನು ಮರುಹೊಂದಿಸಿ ಮತ್ತು 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ಕಾವು ಮಾಡಿ, ನಂತರ ಸೋನಿಕೇಟ್ (15 ನಿಮಿಷ, 5 ಸೆ ಆನ್/ಆಫ್, ಐಸ್ ಮೇಲೆ) ಮತ್ತು ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಜ್ (13,000 rpm)., 30 ನಿಮಿಷ, 4 ° С).ನಂತರ ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು Ni-NTA ರಾಳಕ್ಕೆ (QIAGEN) 4 ° C ನಲ್ಲಿ 3 ಬಾರಿ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ವಾಶ್ ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ 4 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ (50 mM ಟ್ರಿಸ್, pH 8.0, 40 mM ಇಮಿಡಾಜೋಲ್, 250 mM NaCl) ಮತ್ತು ಒಟ್ಟು 3 ಬಾರಿ ಹೊರಹಾಕಲಾಯಿತು. 10 ಮಿಲಿ ಎಲುಯೆಂಟ್ ಬಫರ್ (50 mM ಟ್ರಿಸ್, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM ಇಮಿಡಾಜೋಲ್).WB ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು Qubit™ ಪ್ರೋಟೀನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಕಿಟ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್; Q 33212) ಬಳಸಿ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ RIP ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, 1x RIP ಬಫರ್ (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ರೈಬೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್ (ಪ್ರೋಮೆಗಾ), PMSF (ಬಿಯೋಟೈಮ್ ಬಯೋಟೆಕ್ನಾಲಜಿ), 1 mM DDM, ಕೊಟೇಲ್ 1 ಪ್ರೋಟೀಸ್ (ರೋಚೆ, 1 mM DTT) ಮತ್ತು 4 °C ನಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 13,000 rpm ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ.ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ನಂತರ ಪ್ರೋಟೀನ್ A+G ಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ಮಣಿಗಳಿಂದ (ಮಿಲ್ಲಿಪೋರ್) 5 μg ವಿರೋಧಿ PACT ಪ್ರತಿಕಾಯ (Abeam) ಅಥವಾ IgG (CST) ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿತಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.ಮಣಿಗಳನ್ನು 5x RIP ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ 5 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ, ನಂತರ ಪ್ರೋಟೀನೇಸ್ K (NEB) ನೊಂದಿಗೆ ಜೀರ್ಣವಾಗುತ್ತದೆ.ಆರ್ಎನ್ಎಯನ್ನು ಟ್ರೈಝೋಲ್ನೊಂದಿಗೆ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಆರ್ಟಿ-ಕ್ಯೂಪಿಸಿಆರ್ ನಿರ್ಧರಿಸುತ್ತದೆ.ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 5 ರಲ್ಲಿ ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ RIP ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಪ್ರಮಾಣಿತ RIP ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಪ್ರಕಾರ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಒಟ್ಟು 5 ಪಿಎಂಒಎಲ್ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೆಡ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಆರ್‌ಐಪಿ ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ 1x ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 65 ಡಿಗ್ರಿ ಸೆಲ್ಸಿಯಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ ಅನೆಲ್ ಮಾಡಲಾಗಿದ್ದು ನಂತರ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶಕ್ಕೆ ನಿಧಾನವಾಗಿ ತಂಪಾಗುತ್ತದೆ.E. ಕೊಲಿಯಿಂದ ಒಟ್ಟು 5 pmol ಅಖಂಡ ಅಥವಾ ರೂಪಾಂತರಿತ ಫ್ಲ್ಯಾಗ್-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ PACT ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.4 ಡಿಗ್ರಿ ಸೆಲ್ಸಿಯಸ್‌ನಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಪುನರುಜ್ಜೀವನಗೊಳಿಸಿದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಿ ಮತ್ತು ಆಂಟಿ-ಫ್ಲಾಗ್ ಐಪಿಗಾಗಿ ಆರ್‌ಐಪಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಮೇಲಿನ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ.
RNA ವಿಸ್ತರಣೆ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, 1xRIP ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ 1×107 ಕೋಶಗಳನ್ನು ಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.4 ° C ನಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 13,000 rpm ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಯಾದ ನಂತರ, ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು 30 μl ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ಮಣಿಗಳೊಂದಿಗೆ (ಬೆಕ್ಮನ್) 4 ° C ನಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳವರೆಗೆ ಪೂರ್ವಭಾವಿಯಾಗಿ ಸಂಸ್ಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಂತರ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಲೈಸೇಟ್ ಅನ್ನು ಯೀಸ್ಟ್ tRNA ಯೊಂದಿಗೆ ಸರಬರಾಜು ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 40 pmol ರೀನೇಚರ್ಡ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವು ನೀಡಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಮತ್ತೊಂದು 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಮತ್ತು BSA ಯೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾದ 20 μl ಹೊಸ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ಮಣಿಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.ತೊಳೆಯುವ ಹಂತವು 5x RIP ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ 4 ಬಾರಿ ಮತ್ತು 1x RIP ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ 4 ಬಾರಿ ಒಳಗೊಂಡಿದೆ.ಅನುಗುಣವಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಯೋಟಿನ್ ಎಲುಷನ್ ಬಫರ್ (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-ಬಯೋಟಿನ್, PMSF) ನೊಂದಿಗೆ ಹೊರಹಾಕಲಾಯಿತು ಮತ್ತು NuPAGE 4-12% ಬಿಸ್-ಟ್ರಿಸ್ ಜೆಲ್ (ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜೆನ್) ನಲ್ಲಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗಿದೆ.ಸಿಲ್ವರ್ ಸ್ಟೆನಿಂಗ್ (ಬಯೋಟೈಮ್ ಬಯೋಟೆಕ್ನಾಲಜಿ) ನಂತರ, ಕೆಲವು ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳನ್ನು MS ನಿಂದ ಹೊರಹಾಕಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು.
PACT ಮತ್ತು PKR ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಸಹ-IP ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, 1 x RIP ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 1 x 107 ಲೈಸ್ಡ್ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್ ಲೈಸೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ 13,000 rpm ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ 4 ° C ನಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ತಯಾರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಲೈಸೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರೊಟೀನ್ A + G ಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ಮಣಿಗಳಿಂದ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ, 5 µg ವಿರೋಧಿ PACT ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 4 ° C ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ ನಿಧಾನವಾಗಿ ತಿರುಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಮಣಿಗಳನ್ನು 5×RIP ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ, 1×RIP ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 1×SDS ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಎಲುಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಚೇತರಿಸಿಕೊಂಡ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಅನ್ನು SDS-PAGE ಜೆಲ್ ಮೂಲಕ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು WB ಯಿಂದ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗಿದೆ.
ಫ್ಲ್ಯಾಗ್ ಮಾಡಿದ PACT ನ ಎರಡು pmol ಮತ್ತು PKR ನ 1 pmol ಅನ್ನು E. ಕೊಲಿಯಿಂದ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.1× RIP ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ ಮತ್ತು 4 °C ನಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಪುನರುಜ್ಜೀವನಗೊಳಿಸಿದ RNA ಯ 10 pmol ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಿ.ಅದರ ನಂತರ, ಅವುಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಎರಡು ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಪ್ರೋಟೀನ್ A+G ಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ಬೀಡ್-ಸಂಯೋಜಿತ ವಿರೋಧಿ ಲೇಬಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು.ನಂತರ ಮಣಿಗಳನ್ನು 1x RIP ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ನಾಲ್ಕು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 1x SDS ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಹೊರಹಾಕಲಾಯಿತು.ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ PACT ಮತ್ತು PKR ಅನ್ನು WB ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಿದೆ.