ಸುದ್ದಿ

Nature.com ಗೆ ಭೇಟಿ ನೀಡಿದ್ದಕ್ಕಾಗಿ ಧನ್ಯವಾದಗಳು.ನೀವು ಬಳಸುತ್ತಿರುವ ಬ್ರೌಸರ್ ಆವೃತ್ತಿಯು ಸೀಮಿತ CSS ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಉತ್ತಮ ಅನುಭವಕ್ಕಾಗಿ, ನೀವು ನವೀಕರಿಸಿದ ಬ್ರೌಸರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ನಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ (ಅಥವಾ ಇಂಟರ್ನೆಟ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ಲೋರರ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮೋಡ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿ).ಈ ಮಧ್ಯೆ, ನಿರಂತರ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು ಶೈಲಿಗಳು ಮತ್ತು ಜಾವಾಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಇಲ್ಲದೆ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ರೆಂಡರ್ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ.
ಸಕ್ರಿಯ ಎಸ್ಟರ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಫಿನಾಕ್ಸಿ ರಾಡಿಕಲ್‌ಗಳನ್ನು ಆಧರಿಸಿದ ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಸಾಮೀಪ್ಯ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಜೀವಂತ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ ಉಪಕೋಶದ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂವಾದಕಗಳನ್ನು ನಕ್ಷೆ ಮಾಡಲು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಸಕ್ರಿಯವಾದ ಎಸ್ಟರ್‌ಗಳು ಕಡಿಮೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕವಾಗಿರುತ್ತವೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ವ್ಯಾಪಕ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ತ್ರಿಜ್ಯ, ಮತ್ತು ಪೆರಾಕ್ಸೈಡ್ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಫಿನಾಕ್ಸಿ ರಾಡಿಕಲ್‌ಗಳು ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಮಾರ್ಗಗಳೊಂದಿಗೆ ಮಧ್ಯಪ್ರವೇಶಿಸಬಹುದು.miniSOG ಫೋಟೋಸೆನ್ಸಿಟೈಸರ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಆಸಕ್ತಿಯ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗೆ ತಳೀಯವಾಗಿ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲಾದ ಸಾಮೀಪ್ಯ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಅವಲಂಬಿತ ಫೋಟೋಆಕ್ಟಿವೇಶನ್ (PDPL) ವಿಧಾನವನ್ನು ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ.ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನಿಂದ ಪ್ರಚೋದಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಮತ್ತು ಮಾನ್ಯತೆ ಸಮಯದಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಡುತ್ತದೆ, ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕವನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಅನಿಲೀನ್ ತನಿಖೆಯಿಂದ ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಅವಶೇಷಗಳ ಸ್ಪಾಟಿಯೋಟೆಂಪೋರಲಿ ಪರಿಹರಿಸಲಾದ ಲೇಬಲ್ ಅನ್ನು ಸಾಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಆರ್ಗನೆಲ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ಮ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಮೂಲಕ ನಾವು ಅದರ ಹೆಚ್ಚಿನ ನಿಷ್ಠೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತೇವೆ.TurboID ಜೊತೆ PDPL ನ ಪಕ್ಕ-ಪಕ್ಕದ ಹೋಲಿಕೆಯು PDPL ನ ಹೆಚ್ಚು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ ಮತ್ತು ಸಮಗ್ರವಾದ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.ಮುಂದೆ, ನಾವು ರೋಗ-ಸಂಬಂಧಿತ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನಲ್ ಕೋಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ BRD4 ಮತ್ತು E3 ಪಾರ್ಕಿನ್ ಲಿಗೇಸ್‌ಗೆ PDPL ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಹಿಂದೆ ಅಪರಿಚಿತ ಸಂವಾದಕಗಳನ್ನು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ.ಮಿತಿಮೀರಿದ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಮೂಲಕ, ಪಾರ್ಕಿನ್‌ಗೆ Ssu72 ಮತ್ತು SNW1 ಎಂಬ ಎರಡು ಅಪರಿಚಿತ ತಲಾಧಾರಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ, ಅದರ ಅವನತಿಯು ಸರ್ವತ್ರ-ಪ್ರೋಟೀಸೋಮ್ ಮಾರ್ಗದಿಂದ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯಾಗಿದೆ.
ಪ್ರೋಟೀನ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ಗಳ ನಿಖರವಾದ ಗುಣಲಕ್ಷಣವು ಅನೇಕ ಮೂಲಭೂತ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಆಧಾರವಾಗಿದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ಹೆಚ್ಚು ನಿಖರವಾದ ಸ್ಪಾಟಿಯೊಟೆಂಪೊರಲ್ ಮ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಜೈವಿಕ ಮಾರ್ಗಗಳು, ರೋಗದ ರೋಗಶಾಸ್ತ್ರ ಮತ್ತು ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಉದ್ದೇಶಗಳಿಗಾಗಿ ಈ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಲು ಆಣ್ವಿಕ ಆಧಾರವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.ಈ ನಿಟ್ಟಿನಲ್ಲಿ, ಜೀವಂತ ಜೀವಕೋಶಗಳು ಅಥವಾ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವಿರುವ ವಿಧಾನಗಳು ಹೆಚ್ಚು ಅಪೇಕ್ಷಣೀಯವಾಗಿವೆ.ಅಫಿನಿಟಿ ಪ್ಯೂರಿಫಿಕೇಶನ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ (AP-MS) ಅನ್ನು ಐತಿಹಾಸಿಕವಾಗಿ ಆಸಕ್ತಿಯ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ (POIs) ಬಂಧಿಸುವ ಪಾಲುದಾರರನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಪ್ರೋಟಿಯೊಮಿಕ್ಸ್ ವಿಧಾನಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯೊಂದಿಗೆ, ಬಯೋಪ್ಲೆಕ್ಸ್ 3.0 ಅನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು ಎಪಿ-ಎಂಎಸ್ ಆಧಾರಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ಗಳ ಅತಿದೊಡ್ಡ ಡೇಟಾಬೇಸ್ ಆಗಿದೆ.ಎಪಿ-ಎಂಎಸ್ ಅತ್ಯಂತ ಶಕ್ತಿಯುತವಾಗಿದ್ದರೂ, ವರ್ಕ್‌ಫ್ಲೋನಲ್ಲಿನ ಜೀವಕೋಶದ ವಿಘಟನೆ ಮತ್ತು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವ ಹಂತಗಳು ದುರ್ಬಲ ಮತ್ತು ಅಸ್ಥಿರ ಬಂಧಕ ಸಂವಹನಗಳ ಕಡೆಗೆ ಪಕ್ಷಪಾತವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಮತ್ತು ಲೈಸಿಸ್‌ಗೆ ಮುಂಚಿತವಾಗಿ ವಿಭಾಗೀಕರಣವನ್ನು ಹೊಂದಿರದ ನಕಲಿ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಜೋಡಿಗಳಂತಹ ನಂತರದ ಕಲಾಕೃತಿಗಳನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸುತ್ತವೆ.
ಈ ಸಮಸ್ಯೆಗಳನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಲು, ಕ್ರಾಸ್‌ಲಿಂಕಿಂಗ್ ಗುಂಪುಗಳೊಂದಿಗೆ ಅಸ್ವಾಭಾವಿಕ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು (UAA) ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವಕ ಹತ್ತಿರದ ಲೇಬಲಿಂಗ್ (PL) ಪ್ಲಾಟ್‌ಫಾರ್ಮ್‌ಗಳನ್ನು (ಉದಾ APEX ಮತ್ತು BioID) 5 ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ.UAA ವಿಧಾನವನ್ನು ಅನೇಕ ಸನ್ನಿವೇಶಗಳಲ್ಲಿ ಯಶಸ್ವಿಯಾಗಿ ಅನ್ವಯಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ನೇರ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಂಟುಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ, UAA ಅಳವಡಿಕೆ ಸೈಟ್ನ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಇನ್ನೂ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಹೆಚ್ಚು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, ಇದು ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಘಟನೆಗಳ ವೇಗವರ್ಧಕ ರಿವರ್ಸಲ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರದ ಸ್ಟೊಚಿಯೊಮೆಟ್ರಿಕ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, BioID ವಿಧಾನದಂತಹ ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ PL ವಿಧಾನಗಳು, ಇಂಜಿನಿಯರ್ಡ್ ಬಯೋಟಿನ್ ಲಿಗೇಸ್ ಅನ್ನು POI7 ಗೆ ಬೆಸೆಯುತ್ತವೆ, ಇದು ತರುವಾಯ ಬಯೋಟಿನ್ ಅನ್ನು ಕ್ರಿಯಾಶೀಲ ಬಯೋಟಿನೈಲ್-AMP ಎಸ್ಟರ್ ಮಧ್ಯಂತರವನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.ಕಿಣ್ವವು ಹೀಗೆ ವೇಗವರ್ಧನೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಕ್ರಿಯ ಬಯೋಟಿನ್ "ಕ್ಲೌಡ್" ಅನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಅದು ಪ್ರಾಕ್ಸಿಮಲ್ ಲೈಸಿನ್ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಸಾಕಷ್ಟು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಪಡೆಯಲು BioID ಗೆ 12 ಗಂಟೆಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಸಮಯ ಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ನಿರ್ಣಯದೊಂದಿಗೆ ಅದರ ಬಳಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ.ಯೀಸ್ಟ್ ಡಿಸ್ಪ್ಲೇಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ನಿರ್ದೇಶಿತ ವಿಕಸನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, TurboID ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿಸಲು BioID ಅನ್ನು ಆಧರಿಸಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು 10 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ ಬಯೋಟಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಲೇಬಲ್ ಅನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ, ಹೆಚ್ಚು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ.TurboID ಹೆಚ್ಚು ಸಕ್ರಿಯವಾಗಿರುವುದರಿಂದ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಮಟ್ಟದ ಲೇಬಲಿಂಗ್‌ಗೆ ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ಬಯೋಟಿನ್ ಮಟ್ಟಗಳು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ, ಬಾಹ್ಯ ಬಯೋಟಿನ್ ಸೇರ್ಪಡೆಯಿಂದ ಹೆಚ್ಚು ವರ್ಧಿತ ಮತ್ತು ಸಮಯಕ್ಕೆ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಅಗತ್ಯವಿರುವಾಗ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಸಂಭಾವ್ಯ ಸಮಸ್ಯೆಯಾಗುತ್ತದೆ.ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಸಕ್ರಿಯವಾದ ಎಸ್ಟರ್‌ಗಳು ಕಳಪೆಯಾಗಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕವಾಗಿರುತ್ತವೆ (t1/2 ~5 ನಿಮಿಷ), ಇದು ದೊಡ್ಡ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ತ್ರಿಜ್ಯಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಬಯೋಟಿನ್ 5 ನೊಂದಿಗೆ ನೆರೆಯ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಶುದ್ಧತ್ವದ ನಂತರ. ಇನ್ನೊಂದು ವಿಧಾನದಲ್ಲಿ, ಇಂಜಿನಿಯರ್ಡ್ ಆಸ್ಕೋರ್ಬೇಟ್ ಪೆರಾಕ್ಸಿಡೇಸ್ (ಅಂದರೆ ಬಯೋಟಿನ್- ಫೀನಾಲ್ ರಾಡಿಕಲ್ಗಳು ಮತ್ತು ಒಂದು ನಿಮಿಷದೊಳಗೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ9,10. ಉಪಕೋಶದ ಪ್ರೋಟೀಮ್ಗಳು, ಮೆಂಬರೇನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳು ಮತ್ತು ಸೈಟೋಸೋಲಿಕ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು APEX ಅನ್ನು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಪೆರಾಕ್ಸೈಡ್ಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಅಗತ್ಯವು ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ಗಳು ಅಥವಾ ಮಾರ್ಗಗಳ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಬಹುದು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳು.
ಹೀಗಾಗಿ, ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಮಾರ್ಗಗಳನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸದೆಯೇ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ಮತ್ತು ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ನಿಖರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಲೇಬಲ್-ತ್ರಿಜ್ಯದ ನಿಗ್ರಹ ಜಾತಿಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಹೊಸ ವಿಧಾನವು ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿರುವ ವಿಧಾನಗಳಿಗೆ ಪ್ರಮುಖ ಸೇರ್ಪಡೆಯಾಗಿದೆ. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಜಾತಿಗಳಲ್ಲಿ, ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕವು ಅದರ ಕಡಿಮೆ ಜೀವಿತಾವಧಿ ಮತ್ತು ಸೀಮಿತ ಪ್ರಸರಣ ತ್ರಿಜ್ಯ (ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ t1/2 <0.6 µs) 13 ನಮ್ಮ ಗಮನವನ್ನು ಕೆರಳಿಸಿತು. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಜಾತಿಗಳಲ್ಲಿ, ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕವು ಅದರ ಕಡಿಮೆ ಜೀವಿತಾವಧಿ ಮತ್ತು ಸೀಮಿತ ಪ್ರಸರಣ ತ್ರಿಜ್ಯ (ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ t1/2 <0.6 µs) 13 ನಮ್ಮ ಗಮನವನ್ನು ಕೆರಳಿಸಿತು. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. ಸಕ್ರಿಯ ರೂಪಗಳಲ್ಲಿ, ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕವು ಅದರ ಕಡಿಮೆ ಜೀವಿತಾವಧಿ ಮತ್ತು ಸೀಮಿತ ಪ್ರಸರಣ ತ್ರಿಜ್ಯ (ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ t1/2 <0.6 µs) 13 ನಮ್ಮ ಗಮನವನ್ನು ಸೆಳೆಯಿತು.ಚಿತ್ರ 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). ಸಕ್ರಿಯ ರೂಪಗಳಲ್ಲಿ, ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕವು ನಮ್ಮ ಗಮನವನ್ನು ಸೆಳೆಯುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಅದರ ಕಡಿಮೆ ಜೀವಿತಾವಧಿ ಮತ್ತು ಸೀಮಿತ ಪ್ರಸರಣ ತ್ರಿಜ್ಯ (ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ t1/2 <0.6 μs).ಏಕ ಆಮ್ಲಜನಕವು ಮೆಥಿಯೋನಿನ್, ಟೈರೋಸಿನ್, ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಮತ್ತು ಟ್ರಿಪ್ಟೊಫಾನ್ ಅನ್ನು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕವಾಗಿ ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ವರದಿಯಾಗಿದೆ, ಇದು ಅಮೈನ್ ಅಥವಾ ಥಿಯೋಲ್ ಆಧಾರಿತ ಪ್ರೋಬ್ಸ್ 16,17 ಗೆ ಲಗತ್ತಿಸಲು ಧ್ರುವ 14,15 ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಉಪಕೋಶೀಯ ಕಂಪಾರ್ಟ್‌ಮೆಂಟ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲು ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದ್ದರೂ, ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ POI ಸಾಮೀಪ್ಯ ಗುರುತುಗಳನ್ನು ಮರುಬಳಕೆ ಮಾಡುವ ತಂತ್ರಗಳು ಅನ್ವೇಷಿಸದೆ ಉಳಿದಿವೆ.ಇಲ್ಲಿ, ನಾವು ಫೋಟೋಆಕ್ಟಿವೇಶನ್-ಅವಲಂಬಿತ ಸಾಮೀಪ್ಯ ಲೇಬಲಿಂಗ್ (PDPL) ಎಂಬ ವೇದಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸುತ್ತೇವೆ, ಅಲ್ಲಿ ನಾವು ಮಿನಿಎಸ್‌ಒಜಿ ಫೋಟೋಸೆನ್ಸಿಟೈಸರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಬೆಸೆಯಲಾದ POI ಗಳನ್ನು ಬೆಳಗಿಸಲು ನೀಲಿ ಬೆಳಕನ್ನು ಬಳಸುತ್ತೇವೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಾಕ್ಸಿಮಲ್ ಶೇಷಗಳನ್ನು ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಿಸಲು ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕ ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸುತ್ತೇವೆ, ನಂತರ ರಾಸಾಯನಿಕ ಶೋಧಕಗಳನ್ನು ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಿಸಲು ಅಮೈನ್-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳು ಮಧ್ಯಂತರ ಜೀವಂತ ಕೋಶಗಳು..ಟ್ಯಾಗ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಗರಿಷ್ಠಗೊಳಿಸಲು ನಾವು ರಾಸಾಯನಿಕ ಶೋಧಕಗಳ ಗುಂಪನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ತೆರೆದ ಪ್ರೋಟಿಯೊಮಿಕ್ಸ್ ವರ್ಕ್‌ಫ್ಲೋ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮಾರ್ಪಾಡು ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ.TurboID ಜೊತೆ PDPL ನ ಪಕ್ಕ-ಪಕ್ಕದ ಹೋಲಿಕೆಯು PDPL ನ ಹೆಚ್ಚು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ ಮತ್ತು ಸಮಗ್ರವಾದ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.ಕ್ಯಾನ್ಸರ್-ಸಂಬಂಧಿತ ಎಪಿಜೆನೆಟಿಕ್ ರೆಗ್ಯುಲೇಟರಿ ಪ್ರೊಟೀನ್ BRD4 ಮತ್ತು ಪಾರ್ಕಿನ್ಸನ್ ಕಾಯಿಲೆ-ಸಂಬಂಧಿತ E3 ಲಿಗೇಸ್ ಪಾರ್ಕಿನ್‌ಗಾಗಿ ಉಪಕೋಶದ ಪ್ರೋಟೀಮ್‌ನ ಅಂಗಾಂಗ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಗುರುತುಗಳು ಮತ್ತು ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪಾಲುದಾರರ ಸಾಮಾನ್ಯ ಪ್ರೋಟೀಮ್ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಗೆ ನಾವು ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ತಿಳಿದಿರುವ ಮತ್ತು ಅಜ್ಞಾತ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್ ಎರಡನ್ನೂ ದೃಢೀಕರಿಸಿದೆ. ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳು..ದೊಡ್ಡ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳಲ್ಲಿ E3 ತಲಾಧಾರಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು PDPL ನ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವು ಪರೋಕ್ಷ ಬೈಂಡರ್‌ಗಳ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.ಸರ್ವತ್ರ-ಪ್ರೋಟಿಸೋಮ್ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಎರಡು ಅಜ್ಞಾತ ಪಾರ್ಕಿನ್ ತಲಾಧಾರಗಳನ್ನು ಸಿತು ದೃಢಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಫೋಟೊಡೈನಾಮಿಕ್ ಥೆರಪಿ (PDT)19 ಮತ್ತು ಕ್ರೋಮೋಫೋರ್-ಸಹಾಯದ ಲೇಸರ್ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ (CALI)20, ಇದರಲ್ಲಿ ಫೋಟೊಸೆನ್ಸಿಟೈಜರ್‌ಗಳೊಂದಿಗಿನ ಬೆಳಕಿನ ವಿಕಿರಣವು ಏಕ ಆಮ್ಲಜನಕವನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ, ಗುರಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಬಹುದು ಅಥವಾ ಜೀವಕೋಶದ ಸಾವಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು.ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕವು ಸುಮಾರು 70 nm ನ ಸೈದ್ಧಾಂತಿಕ ಪ್ರಸರಣ ಅಂತರವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ವಸ್ತುವಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ಫೋಟೊಸೆನ್ಸಿಟೈಸರ್ ಸುತ್ತಲೂ ಪ್ರಾದೇಶಿಕವಾಗಿ ಸೀಮಿತ ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಣವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಬಹುದು.ಈ ಪರಿಕಲ್ಪನೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ, ಜೀವಂತ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ನಿಕಟ ಲೇಬಲ್ ಅನ್ನು ಸಾಧಿಸಲು ನಾವು ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕವನ್ನು ಬಳಸಲು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ.ನಾವು ನಾಲ್ಕು ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ಪೂರೈಸಲು PDPL ಕೆಮೊಪ್ರೊಟೊಮಿಕ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ: (1) PL ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ವಿಧಾನದಂತೆಯೇ ಸಕ್ರಿಯ ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕದ ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸಲು;(2) ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಾರಂಭದ ಮೇಲೆ ಸಮಯ-ಪರಿಹರಿಸಿದ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಒದಗಿಸಿ;(3) ಬದಲಾವಣೆಯ ಮೂಲಕ (4) ಹಿನ್ನೆಲೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ಕಾಫ್ಯಾಕ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು (ಬಯೋಟಿನ್‌ನಂತಹ) ಬಳಸುವುದನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ, ಅಥವಾ ಪರಿಸರದ ಒತ್ತಡಕ್ಕೆ ಜೀವಕೋಶದ ಒಡ್ಡಿಕೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಹೆಚ್ಚು ವಿಚಲಿತಗೊಳಿಸುವ ಬಾಹ್ಯ ಕಾರಕಗಳನ್ನು (ಪೆರಾಕ್ಸೈಡ್‌ಗಳಂತಹ) ಬಳಸಿ.
ಫೋಟೊಸೆನ್ಸಿಟೈಸರ್‌ಗಳನ್ನು ಸಣ್ಣ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದ ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್‌ಗಳು (ಉದಾ. ಗುಲಾಬಿ ಬೆಂಗಾಲ್, ಮೆಥಿಲೀನ್ ನೀಲಿ) 22 ಮತ್ತು ತಳೀಯವಾಗಿ ಎನ್‌ಕೋಡ್ ಮಾಡಲಾದ ಸಣ್ಣ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು (ಉದಾ miniSOG, KillerRed) 23 ಸೇರಿದಂತೆ ಎರಡು ವರ್ಗಗಳಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಬಹುದು.ಮಾಡ್ಯುಲರ್ ವಿನ್ಯಾಸವನ್ನು ಸಾಧಿಸಲು, POI24,25 (ಚಿತ್ರ 1a) ಗೆ ಫೋಟೋಸೆನ್ಸಿಟೈಸರ್ (PS) ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಾವು ಮೊದಲ ತಲೆಮಾರಿನ PDPL ಪ್ಲಾಟ್‌ಫಾರ್ಮ್ ಅನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ.ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನಿಂದ ವಿಕಿರಣಗೊಳಿಸಿದಾಗ, ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕವು ಪ್ರಾಕ್ಸಿಮಲ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಫಿಲಿಕ್ ಅಮೈನೊ ಆಸಿಡ್ ಉಳಿಕೆಗಳನ್ನು ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫಿಲಿಕ್ ಮತ್ತು ಅಮೈನ್ ಪ್ರೋಬ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಫೈಲ್ಸ್ 16,17 ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸುವ ಉಂಪೋಲಂಗ್ ಧ್ರುವೀಯತೆ ಉಂಟಾಗುತ್ತದೆ.ಕ್ಲಿಕ್ ರಸಾಯನಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಅನುಮತಿಸಲು ಮತ್ತು LC/MS/MS ಗುಣಲಕ್ಷಣಕ್ಕಾಗಿ ಕೆಳಕ್ಕೆ ಎಳೆಯಲು ಅಲ್ಕಿನ್ ಹ್ಯಾಂಡಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೋಬ್ ಅನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ.
miniSOG ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ಲೇಬಲಿಂಗ್‌ನ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ವಿವರಣೆ.ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿಗೆ ತೆರೆದುಕೊಂಡಾಗ, miniSOG-POI ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಜೀವಕೋಶಗಳು ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕವನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತವೆ, ಇದು ಪರಸ್ಪರ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾರ್ಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಆದರೆ ಬಂಧಿಸದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಲ್ಲ.ಫೋಟೊಆಕ್ಸಿಡೀಕರಣದ ಮಧ್ಯಂತರ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಅಮೈನ್ ರಾಸಾಯನಿಕ ತನಿಖೆಯ ರಿಲೇ ಲೇಬಲ್‌ಗಳು ಕೋವೆಲೆಂಟ್ ಅಡಕ್ಟ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತವೆ.ರಸಾಯನಶಾಸ್ತ್ರ ಪ್ರೋಬ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಆಲ್ಕೈನೈಲ್ ಗುಂಪು LC-MS/MS ಪರಿಮಾಣದ ನಂತರ ಪುಲ್-ಡೌನ್ ಮೂಲಕ ಪುಲ್ಟ್‌ಮೆಂಟ್‌ಗಾಗಿ ಕ್ಲಿಕ್ ಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿಯನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ.b ಅಮೈನ್ ಶೋಧಕಗಳ ರಾಸಾಯನಿಕ ರಚನೆ 1-4.c ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಸ್ಥಳೀಕರಿಸಿದ miniSOG-ಮಧ್ಯಸ್ಥ ಪ್ರೋಟಿಯೊಮಿಕ್ ಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳ ಪ್ರಾತಿನಿಧಿಕ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಜೆಲ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ 1-4 ಮತ್ತು ಜೆಲ್ ಡೆನ್ಸಿಟೋಮೆಟ್ರಿಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ.ರಾಸಾಯನಿಕ ಶೋಧಕಗಳ ಸಿಗ್ನಲ್-ಟು-ಹಿನ್ನೆಲೆ ಅನುಪಾತವನ್ನು ನೀಲಿ ಬೆಳಕನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ ನಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ಅಥವಾ miniSOG ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಇಲ್ಲದೆ HEK293T ಕೋಶಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ನಿರ್ಣಯಿಸಲಾಗಿದೆ.n = 2 ಜೈವಿಕವಾಗಿ ಸ್ವತಂತ್ರ ಮಾದರಿಗಳು.ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಬಿಂದುವು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.c ನಂತಹ ಸೂಚಿಸಲಾದ PDPL ಘಟಕಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿ ಅಥವಾ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಆಪ್ಟಿಮೈಸ್ಡ್ ಪ್ರೋಬ್ 3 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು PDPL ನ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಪತ್ತೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ.n = 3 ಜೈವಿಕವಾಗಿ ಸ್ವತಂತ್ರ ಮಾದರಿಗಳು.ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಬಿಂದುವು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.ಮಧ್ಯರೇಖೆಗಳು ಮತ್ತು ವಿಸ್ಕರ್‌ಗಳು ಸರಾಸರಿ ಮತ್ತು ± ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ.CBB: ಕೂಮಾಸ್ಸಿ ಬ್ರಿಲಿಯಂಟ್ ಬ್ಲೂ.ಇ ದೂರದ-ಕೆಂಪು Si-DMA ಸ್ಟೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕದ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್.ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್: 10 µm.ಜೆಲ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಸ್ವತಂತ್ರವಾಗಿ ಕನಿಷ್ಠ ಎರಡು ಬಾರಿ ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್‌ನ ಪ್ರೊಪರ್ಗೈಲಾಮೈನ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ರಾಸಾಯನಿಕ ತನಿಖೆಯಾಗಿ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸಲು HEK293T ನಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾದ ಪ್ರೌಢ ಫೋಟೊಸೆನ್ಸಿಟೈಸರ್‌ಗಳಾದ miniSOG26 ಮತ್ತು KillerRed23 ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ನಾವು ಮೊದಲು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 1a).ಜೆಲ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಮಿನಿಎಸ್ಒಜಿ ಮತ್ತು ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನ ವಿಕಿರಣವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಸಾಧಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ, ಆದರೆ ಕಿಲ್ಲರ್‌ರೆಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಯಾವುದೇ ಗೋಚರ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ.ಸಿಗ್ನಲ್-ಟು-ಹಿನ್ನೆಲೆ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು, ನಾವು ಅನಿಲೀನ್ (1 ಮತ್ತು 3), ಪ್ರೊಪಿಲಮೈನ್ (2), ಅಥವಾ ಬೆಂಜೈಲಮೈನ್ (4) ಹೊಂದಿರುವ ರಾಸಾಯನಿಕ ಶೋಧಕಗಳ ಗುಂಪನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ.HEK293T ಕೋಶಗಳು ಯಾವುದೇ ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಬಹುಶಃ ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ರೈಬೋಫ್ಲಾವಿನ್ ಫೋಟೋಸೆನ್ಸಿಟೈಸರ್, ಫ್ಲಾವಿನ್ ಮಾನೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ (FMN) 27 . ಅನಿಲೀನ್-ಆಧಾರಿತ ರಾಸಾಯನಿಕ ಶೋಧಕಗಳು 1 ಮತ್ತು 3 ಉತ್ತಮ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ನೀಡಿತು, HEK293T ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾದಲ್ಲಿ miniSOG ಅನ್ನು ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುತ್ತದೆ, ಪ್ರೋಬ್ 3 ಗಾಗಿ ಸಿಗ್ನಲ್‌ನಲ್ಲಿ 8-ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ RNA-ಲೇಬಲಿಂಗ್ ವಿಧಾನದಲ್ಲಿ CAP-seq ನಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಪ್ರೋಬ್ 2 ~2.5- ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ. RNA ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ (Fig. 1b, c) ನಡುವಿನ ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಆದ್ಯತೆಗಳಿಂದಾಗಿ ಪಟ್ಟು ಸಿಗ್ನಲ್ ಹೆಚ್ಚಳ. ಅನಿಲೀನ್-ಆಧಾರಿತ ರಾಸಾಯನಿಕ ಶೋಧಕಗಳು 1 ಮತ್ತು 3 ಉತ್ತಮ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ನೀಡಿತು, HEK293T ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾದಲ್ಲಿ miniSOG ಅನ್ನು ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುತ್ತದೆ, ಪ್ರೋಬ್ 3 ಗಾಗಿ ಸಿಗ್ನಲ್‌ನಲ್ಲಿ 8-ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ RNA-ಲೇಬಲಿಂಗ್ ವಿಧಾನದಲ್ಲಿ CAP-seq ನಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಪ್ರೋಬ್ 2 ~2.5- ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ. RNA ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ (Fig. 1b, c) ನಡುವಿನ ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಆದ್ಯತೆಗಳಿಂದಾಗಿ ಪಟ್ಟು ಸಿಗ್ನಲ್ ಹೆಚ್ಚಳ.ಅನಿಲೀನ್-ಆಧಾರಿತ ರಾಸಾಯನಿಕ ಶೋಧಕಗಳು 1 ಮತ್ತು 3 ಉತ್ತಮ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿವೆ: ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾದಲ್ಲಿ miniSOG ಅನ್ನು ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ HEK293T, ಪ್ರೋಬ್ 3 ಗಾಗಿ ಸಿಗ್ನಲ್‌ನಲ್ಲಿ 8 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚು ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಪ್ರೋಬ್ 2 ಅನ್ನು CAP-seq RNA ಲೇಬಲಿಂಗ್ ವಿಧಾನದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಮಾತ್ರ ~2.5 ಪಟ್ಟು ಸಿಗ್ನಲ್ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಬಹುಶಃ ಆರ್ಎನ್ಎ ಮತ್ತು ಪ್ರೊಟೀನ್ ನಡುವಿನ ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಆದ್ಯತೆಗಳಿಂದಾಗಿ (Fig. 1b, c).. 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b, c）。. -倍信号增加，可能是由于RNAಅನಿಲೀನ್-ಆಧಾರಿತ ರಾಸಾಯನಿಕ ಶೋಧಕಗಳು 1 ಮತ್ತು 3 ಉತ್ತಮ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದವು, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾದಲ್ಲಿ HEK293T ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಿದ miniSOG, ಮತ್ತು ಪ್ರೋಬ್ 3 ಸಿಗ್ನಲ್‌ನಲ್ಲಿ 8-ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಹೊಂದಿತ್ತು, ಆದರೆ CAP-seq RNA ಲೇಬಲಿಂಗ್ ವಿಧಾನಕ್ಕಾಗಿ ತನಿಖೆ 2 ಕೇವಲ ~2.5-ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ.ಸಿಗ್ನಲ್‌ನಲ್ಲಿ, ಬಹುಶಃ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮತ್ತು ಪ್ರೊಟೀನ್ ನಡುವಿನ ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಆದ್ಯತೆಗಳಿಂದಾಗಿ (Fig. 1b, c).ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಪ್ರೋಬ್ 3 ಐಸೋಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಹೈಡ್ರಜೈನ್ ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳನ್ನು (ಪ್ರೋಬ್ಸ್ 5, 6, 7) ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು ಪ್ರೋಬ್ 3 (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗ್. 1 ಬಿ, ಸಿ) ನ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಅನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸುತ್ತದೆ.ಅಂತೆಯೇ, ಇನ್-ಜೆಲ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಇತರ ಆಪ್ಟಿಮೈಸ್ಡ್ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು: ವಿಕಿರಣ ತರಂಗಾಂತರ (460 nm), ರಾಸಾಯನಿಕ ತನಿಖೆಯ ಸಾಂದ್ರತೆ (1 mM), ಮತ್ತು ವಿಕಿರಣ ಸಮಯ (20 ನಿಮಿಷ) (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 2a-c).PDPL ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಘಟಕ ಅಥವಾ ಹಂತವನ್ನು ಬಿಟ್ಟುಬಿಡುವುದರಿಂದ ಹಿನ್ನೆಲೆಗೆ ಗಮನಾರ್ಹ ಸಿಗ್ನಲ್ ರಿವರ್ಸಲ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು (Fig. 1d).ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ಸೋಡಿಯಂ ಅಜೈಡ್ ಅಥವಾ ಟ್ರೊಲಾಕ್ಸ್‌ನ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕವನ್ನು ತಣಿಸುತ್ತದೆ.ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕವನ್ನು ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸಲು ತಿಳಿದಿರುವ D2O ಉಪಸ್ಥಿತಿಯು ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ.ಲೇಬಲಿಂಗ್‌ಗೆ ಇತರ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಆಮ್ಲಜನಕ ಪ್ರಭೇದಗಳ ಕೊಡುಗೆಯನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು, ಕ್ರಮವಾಗಿ 18, 29 ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸಿಲ್ ಮತ್ತು ಸೂಪರ್ಆಕ್ಸೈಡ್ ರಾಡಿಕಲ್ ಸ್ಕ್ಯಾವೆಂಜರ್‌ಗಳನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಲು ಮನ್ನಿಟಾಲ್ ಮತ್ತು ವಿಟಮಿನ್ ಸಿ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು, ಆದರೆ ಅವು ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಕಂಡುಬಂದಿಲ್ಲ.H2O2 ನ ಸೇರ್ಪಡೆ, ಆದರೆ ಪ್ರಕಾಶವಲ್ಲ, ಲೇಬಲ್ ಮಾಡುವಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಲಿಲ್ಲ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 3a).Si-DMA ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳೊಂದಿಗಿನ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಸಿಂಗಲ್ ಆಕ್ಸಿಜನ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ HEK293T-miniSOG ವೈರ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕದ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿತು, ಆದರೆ ಮೂಲ HEK293T ತಂತಿಯಲ್ಲಿ ಅಲ್ಲ.ಜೊತೆಗೆ, ಮಿಟೊಸಾಕ್ಸ್ ರೆಡ್‌ಗೆ ಪ್ರಕಾಶದ ನಂತರ ಸೂಪರ್‌ಆಕ್ಸೈಡ್ ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗಲಿಲ್ಲ (Fig. 1e ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 3b) 30. ಈ ಡೇಟಾವು ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕವು ನಂತರದ ಪ್ರೋಟಿಯೊಮಿಕ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾದ ಮುಖ್ಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಆಮ್ಲಜನಕ ಜಾತಿಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ಬಲವಾಗಿ ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನ ವಿಕಿರಣ ಮತ್ತು ರಾಸಾಯನಿಕ ಶೋಧಕಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ PDPL ನ ಸೈಟೊಟಾಕ್ಸಿಸಿಟಿಯನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಲಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಯಾವುದೇ ಗಮನಾರ್ಹ ಸೈಟೊಟಾಕ್ಸಿಸಿಟಿಯನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 4a).
ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು LC-MS/MS ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ಪ್ರೋಟಿಯೊಮಿಕ್ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು, ನಾವು ಮೊದಲು ಯಾವ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳನ್ನು ಮಾರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಬ್ ಲೇಬಲ್‌ಗಳ ಡೆಲ್ಟಾ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಬೇಕು.ಮೆಥಿಯೋನಿನ್, ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್, ಟ್ರಿಪ್ಟೊಫಾನ್ ಮತ್ತು ಟೈರೋಸಿನ್ ಅನ್ನು ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕದಿಂದ ಮಾರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ವರದಿಯಾಗಿದೆ 14,15.MSFragger32 ಅನ್ನು ಆಧರಿಸಿ FragPipe ಕಂಪ್ಯೂಟಿಂಗ್ ಪ್ಲಾಟ್‌ಫಾರ್ಮ್ ಒದಗಿಸಿದ ಪಕ್ಷಪಾತವಿಲ್ಲದ ಮುಕ್ತ ಹುಡುಕಾಟದೊಂದಿಗೆ ನಾವು TOP-ABPP31 ವರ್ಕ್‌ಫ್ಲೋ ಅನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುತ್ತೇವೆ.ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಕ್ಸಿಜನ್ ಮಾರ್ಪಾಡು ಮತ್ತು ರಾಸಾಯನಿಕ ಪ್ರೋಬ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ನಂತರ, ಕ್ಲೀವಬಲ್ ಲಿಂಕರ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಬಯೋಟಿನ್ ಕಡಿತ ಲೇಬಲ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕ್ಲಿಕ್ ರಸಾಯನಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ನ್ಯೂಟ್ರಾವಿಡಿನ್ ಸ್ಟ್ರೆಚಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆ.ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು ಇನ್ನೂ ರಾಳಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ, LC-MS/MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಫೋಟೋಕ್ಲೀವ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 2a ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಡೇಟಾ 1).50 ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮ್ಯಾಪ್ (PSM) ಹೊಂದಾಣಿಕೆಗಳನ್ನು ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾದ (Fig. 2b) ಜೊತೆಗೆ ಪ್ರೋಟೀಮ್‌ನಾದ್ಯಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳು ಸಂಭವಿಸಿದವು.ಆಶ್ಚರ್ಯಕರವಾಗಿ, ನಾವು ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್‌ನ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಬಹುಶಃ ಇತರ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳಿಗಿಂತ ಅನಿಲೀನ್ ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳ ಕಡೆಗೆ ಆಕ್ಸಿಡೀಕೃತ ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕತೆಯ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ.ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕದಿಂದ ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಣದ ಪ್ರಕಟಿತ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದ ಪ್ರಕಾರ, 21,33 ಪ್ರಸ್ತಾವಿತ ಡೆಲ್ಟಾ-ಮಾಸ್ ರಚನೆಯು +229 Da ಎರಡು ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಣದ ನಂತರ 2-ಆಕ್ಸೊ-ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಜೊತೆಗೆ ಪ್ರೋಬ್ 3 ನ ಸೇರ್ಪಡೆಗೆ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ, ಆದರೆ +247 Da ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ಉತ್ಪನ್ನವಾಗಿದೆ. +229 ಡಾ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 5).MS2 ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್‌ನ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನವು ಹೆಚ್ಚಿನ y ಮತ್ತು b ಅಯಾನುಗಳ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಯ ಹೆಚ್ಚಿನ ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹತೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ, ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ತುಣುಕು ಅಯಾನುಗಳ (y ಮತ್ತು b) (Fig. 2c) ಗುರುತಿಸುವಿಕೆ ಸೇರಿದಂತೆ.PDPL-ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಹಿಸ್ಟೈಡಿನ್‌ಗಳ ಸ್ಥಳೀಯ ಅನುಕ್ರಮದ ಸಂದರ್ಭ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ±1 ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣ ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಅವಶೇಷಗಳಿಗೆ ಮಧ್ಯಮ ಮೋಟಿಫ್ ಆದ್ಯತೆಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 4b).ಸರಾಸರಿಯಾಗಿ, ಪ್ರತಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗೆ 1.4 ಹಿಸ್ಟೈಡಿನ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಈ ಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳ ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ದ್ರಾವಕ ಪ್ರವೇಶಿಸಬಹುದಾದ ಮೇಲ್ಮೈ ಪ್ರದೇಶ (SASA) ಮತ್ತು ಸಾಪೇಕ್ಷ ದ್ರಾವಕ ಲಭ್ಯತೆ (RSA) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ಪೂರಕ Fig. 4c,d) ಮೂಲಕ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
MSFragger ನಿಂದ ನಡೆಸಲ್ಪಡುವ FragPipe ಕಂಪ್ಯೂಟಿಂಗ್ ಪ್ಲಾಟ್‌ಫಾರ್ಮ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಉಳಿದ ಆಯ್ಕೆಯನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಪಕ್ಷಪಾತವಿಲ್ಲದ ಕೆಲಸದ ಹರಿವು.ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ರಾಳದಿಂದ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಫೋಟೊಕ್ಲೀವೇಜ್ ಅನ್ನು ಅನುಮತಿಸಲು ಕ್ಲಿವಬಲ್ ಲಿಂಕರ್‌ಗಳನ್ನು ಕ್ಲಿಕ್ ರಸಾಯನಶಾಸ್ತ್ರದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಹಲವಾರು ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳನ್ನು ಮತ್ತು ಸಂಬಂಧಿತ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಮುಕ್ತ ಹುಡುಕಾಟವನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಲಾಯಿತು.b ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಸಂಭವಿಸುವ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳ ಸಮೂಹವನ್ನು ನಿಯೋಜಿಸಿ.ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮ್ಯಾಪಿಂಗ್ PSM.c MS2 ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಸೈಟ್‌ಗಳ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಲ್ ಟಿಪ್ಪಣಿಯನ್ನು ಪ್ರೋಬ್ 3 ನೊಂದಿಗೆ ಮಾರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ. ಪ್ರಾತಿನಿಧಿಕ ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ, ಪ್ರೋಬ್ 3 ನೊಂದಿಗೆ ಕೋವೆಲನ್ಸಿಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಕ್ಕೆ +229.0938 Da ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿತು.d ಮ್ಯುಟೇಶನ್ ಅಸ್ಸೇ ಅನ್ನು PDPL ಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.PRDX3 (H155A, H225A) ಮತ್ತು PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ಧ್ವಜ ವಿರೋಧಿ ಪತ್ತೆಗಾಗಿ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು.ಇ ಸಿಂಥೆಟಿಕ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು ಪ್ರೋಬ್ 3 ರ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ miniSOG ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು LC-MS ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್‌ನಲ್ಲಿ Δm +247 ಮತ್ತು +229 ನೊಂದಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾದ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ.f miniSOG-6xHis-ಟ್ಯಾಗ್ ಮತ್ತು ಆಂಟಿ-6xHis ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಮಾದರಿಯ ವಿಟ್ರೊ ಪ್ರೋಟೀನ್-ಟು-ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳು.ಆಂಟಿಬಯೋಟಿನ್ (ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್-HRP) ಮತ್ತು miniSOG-6xHis/anti-6xHis ಪ್ರತಿಕಾಯ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ಆಂಟಿಬಯೋಟಿನ್ (ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್-HRP) ಮತ್ತು ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಬೆಳಕಿಗೆ ಒಡ್ಡಿಕೊಳ್ಳುವ ಸಮಯವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ ಪ್ರೋಬ್ 3 ನೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಲೇಬಲ್‌ಗಳನ್ನು ಅನುಗುಣವಾದ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ: LC ಪ್ರತಿಕಾಯ ಬೆಳಕಿನ ಸರಪಳಿ, HC ಪ್ರತಿಕಾಯ ಭಾರೀ ಸರಪಳಿ.ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಈ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಸ್ವತಂತ್ರವಾಗಿ ಕನಿಷ್ಠ ಎರಡು ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ನ ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ಪರಿಶೀಲನೆಗಾಗಿ, ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಯಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾದ PRDX3 ಮತ್ತು PRDX1 ಅನ್ನು ಹಿಸ್ಟೈಡಿನ್‌ನಿಂದ ಅಲನೈನ್‌ಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ವರ್ಗಾವಣೆ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ವೈಲ್ಡ್ ಪ್ರಕಾರಕ್ಕೆ ಹೋಲಿಸಲಾಗಿದೆ.PDPL ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ರೂಪಾಂತರವು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (Fig. 2d).ಏತನ್ಮಧ್ಯೆ, ತೆರೆದ ಹುಡುಕಾಟದಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಪ್ರೋಬ್ 3 ಮತ್ತು ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ miniSOG ನೊಂದಿಗೆ ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸಲಾಯಿತು, LC-MS ನಿಂದ ಪತ್ತೆಯಾದಾಗ +247 ಮತ್ತು +229 Da ದ್ರವ್ಯರಾಶಿಯ ಬದಲಾವಣೆಯೊಂದಿಗೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ .2e).)ಮಿನಿಎಸ್‌ಒಜಿ ಫೋಟೋಆಕ್ಟಿವೇಶನ್‌ಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಸಂವಾದಾತ್ಮಕ ಪ್ರಾಕ್ಸಿಮಲ್ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಬಹುದೇ ಎಂದು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ನಾವು miniSOG-6xHis ಪ್ರೊಟೀನ್ ಮತ್ತು ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿನ ಆಂಟಿ-ಹಿಸ್ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಆಂಟಿಬಾಡಿ (ಚಿತ್ರ 2f) ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಮೂಲಕ ಕೃತಕ ಸಾಮೀಪ್ಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಈ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ, miniSOG ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿಕಾಯ ಹೆವಿ ಮತ್ತು ಲೈಟ್ ಚೈನ್‌ಗಳ ಪ್ರಾಕ್ಸಿಮಲ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ನಾವು ನಿರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ.ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ (ಆಂಟಿ-6xHis-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ಪ್ರತಿಕಾಯದ ಭಾರವಾದ ಮತ್ತು ಹಗುರವಾದ ಸರಪಳಿಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವುದು) ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟ್‌ಗಳು ಭಾರವಾದ ಮತ್ತು ಹಗುರವಾದ ಸರಪಳಿಗಳ ಬಲವಾದ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ.ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, 6xHis ಟ್ಯಾಗ್ ಮತ್ತು ಲೈಟ್ ಮತ್ತು ಹೆವಿ ಚೈನ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಅಡ್ಡ-ಲಿಂಕ್‌ಗಳಿಂದಾಗಿ ನಾವು miniSOG ಆಟೋಬಯೋಟಿನೈಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಲೈಸಿನ್ ಮತ್ತು 2-ಆಕ್ಸೋ-ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಪ್ರಾಕ್ಸಿಮಲ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಡುವಿನ ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ ಅಂತರಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿರಬಹುದು.ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ, ಪಿಡಿಪಿಎಲ್ ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಅನ್ನು ಸಾಮೀಪ್ಯ ಅವಲಂಬಿತ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ತೀರ್ಮಾನಿಸುತ್ತೇವೆ.
ಇನ್ ಸಿತು ಲೇಬಲಿಂಗ್‌ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಉಪಕೋಶೀಯ ಪ್ರೋಟೀಮ್ ಅನ್ನು ನಿರೂಪಿಸುವುದು ನಮ್ಮ ಮುಂದಿನ ಗುರಿಯಾಗಿದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಅಥವಾ HEK293T ಜೀವಕೋಶಗಳ ಹೊರಗಿನ ER ಮೆಂಬರೇನ್‌ನಲ್ಲಿ miniSOG ಅನ್ನು ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ (Fig. 3a).ಜೆಲ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಮೂರು ಉಪಕೋಶೀಯ ಸ್ಥಳಗಳಲ್ಲಿ ಹೇರಳವಾಗಿ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳನ್ನು ಮತ್ತು ವಿಭಿನ್ನ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು (Fig. 3b).ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು PDPL ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (Fig. 3c).PDPL ವರ್ಕ್‌ಫ್ಲೋ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಉಪಕೋಶೀಯ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್‌ಗಳನ್ನು ವಿವರಿಸಲು ರೋಡಮೈನ್ ವರ್ಣಗಳೊಂದಿಗೆ ಕ್ಲಿಕ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಅನುಸರಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು PDPL ಸಂಕೇತಗಳನ್ನು DAPI, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಟ್ರ್ಯಾಕರ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ER ಟ್ರ್ಯಾಕರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು PDPL ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ನಿಷ್ಠೆಯನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸುತ್ತದೆ.ಮೂರು ಅಂಗಾಂಗ ಸ್ಥಳಗಳಿಗೆ, ಅವಿಡಿನ್ ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಟರ್ಬೊಐಡಿಯೊಂದಿಗೆ PDPL ನ ಪಕ್ಕ-ಪಕ್ಕದ ಹೋಲಿಕೆಯು PDPL ಅನ್ನು ಅವುಗಳ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಹೆಚ್ಚು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ.PDPL ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ, ಹೆಚ್ಚು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು ಕಾಣಿಸಿಕೊಂಡವು, ಇದು ಹೆಚ್ಚು PDPL-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗ್. 6a-d).
miniSOG-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ ಅಂಗಾಂಗ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್‌ನ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯ.miniSOG ಮಾನವನ COX4 (mito-miniSOG) ನ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ 23 ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳಿಗೆ ಸಮ್ಮಿಳನದ ಮೂಲಕ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ಗುರಿಪಡಿಸುತ್ತದೆ, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್ H2B (ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್-miniSOG) ಗೆ ಸಮ್ಮಿಳನದ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು Sec61β ER ಪೊರೆಯ ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಬದಿಯ ಮೂಲಕ (ER-miniSOG) )ಸೂಚನೆಗಳಲ್ಲಿ ಜೆಲ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್, ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ ಸೇರಿವೆ.b ಮೂರು ಅಂಗಕ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ PDPL ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ಗಳ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಜೆಲ್ ಚಿತ್ರಗಳು.CBB ಕೂಮಾಸ್ಸಿ ಬ್ರಿಲಿಯಂಟ್ ಬ್ಲೂ.c HEK293T ಕೋಶಗಳ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಚಿತ್ರಗಳು miniSOG ಅನ್ನು ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ವಿವಿಧ ಉಪಕೋಶೀಯ ಸ್ಥಳೀಕರಣಗಳೊಂದಿಗೆ V5 (ಕೆಂಪು) ಎಂದು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರತಿಕಾಯದಿಂದ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗಿದೆ.ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾ ಮತ್ತು ಇಆರ್ (ಹಸಿರು) ಗಾಗಿ ಉಪಕೋಶೀಯ ಗುರುತುಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.PDPL ವರ್ಕ್‌ಫ್ಲೋ Cy3-azide ಕ್ಲಿಕ್ ರಸಾಯನಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು miniSOG (ಹಳದಿ) ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಉಪಕೋಶೀಯ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್‌ಗಳ ಪತ್ತೆಯನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ.ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್: 10 µm.d ಜ್ವಾಲಾಮುಖಿ ಪ್ಲಾಟ್‌ಗಳ PDPL-ಟ್ಯಾಗ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೋಟೀಮ್‌ಗಳು ವಿವಿಧ ಅಂಗಕಗಳಲ್ಲಿ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡದ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣದಿಂದ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ (n = 3 ಸ್ವತಂತ್ರ ಜೈವಿಕ ಪ್ರಯೋಗಗಳು).ಜ್ವಾಲಾಮುಖಿ ಪ್ಲಾಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಎರಡು-ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.HEK293T ವೈಲ್ಡ್ ಪ್ರಕಾರವನ್ನು ನಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಬದಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ (p <0.05 ಮತ್ತು >2-ಪಟ್ಟು ಅಯಾನು ತೀವ್ರತೆಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸ). ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಬದಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ (p <0.05 ಮತ್ತು >2-ಪಟ್ಟು ಅಯಾನು ತೀವ್ರತೆಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸ). Значительно изменнные белки выделены krasnыm цветом (p < 0,05 и >2-ಕ್ರ್ಯಾತ್ನಯ ರಝ್ನಿಷಿಯಾ ಮತ್ತು ಇಂಟೆನ್ಸ್ವಿನೊಸ್ಟ್). ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಬದಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ (p <0.05 ಮತ್ತು >2-ಪಟ್ಟು ಅಯಾನು ತೀವ್ರತೆಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸ).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены krasnым цветом (p <0,05 и > 2-ಕ್ರಾಟ್ನಯ ರಝನಿಸಾ ಮತ್ತು ионной силеа). ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಬದಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ (p <0.05 ಮತ್ತು > 2-ಪಟ್ಟು ಅಯಾನಿಕ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದ ವ್ಯತ್ಯಾಸ).HEK293T-miniSOG ಗಾಗಿ ಮುಖ್ಯವಾದ ಸಂಬಂಧಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಹಸಿರು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಇ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ಪ್ರೋಟಿಯೊಮಿಕ್ ಡೇಟಾಸೆಟ್‌ಗಳ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಡಿ.ಪ್ರತಿ ಅಂಗಾಂಗದಲ್ಲಿ (ಕೆಂಪು ಮತ್ತು ಹಸಿರು ಚುಕ್ಕೆಗಳು) ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಮಹತ್ವದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಒಟ್ಟು ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಮೇಲ್ಭಾಗದಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ.ಹಿಸ್ಟೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳು ಮೈಟೊಕಾರ್ಟಾ 3.0, GO ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು A. ಟಿಂಗ್ ಎಟ್ ಆಲ್‌ಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಅಂಗಕಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ಥಳೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.ಜನರು.ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾ, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ER ಗಾಗಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಡೇಟಾಸೆಟ್‌ಗಳು.ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಈ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಸ್ವತಂತ್ರವಾಗಿ ಕನಿಷ್ಠ ಎರಡು ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಗಿದೆ.ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾವನ್ನು ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾ ಫೈಲ್‌ಗಳ ರೂಪದಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಜೆಲ್ ಮತ್ತು ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಂದ ಉತ್ತೇಜಿತವಾಗಿ, ಪ್ರತಿ ಅಂಗಾಂಗದಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ಅನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು ಲೇಬಲ್-ಮುಕ್ತ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು (ಪೂರಕ ಡೇಟಾ 2).ಹಿನ್ನೆಲೆ ಗುರುತುಗಳನ್ನು ಕಳೆಯಲು ಋಣಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ವರ್ಗಾವಣೆಯಾಗದ HEK293T ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ. ಜ್ವಾಲಾಮುಖಿಯ ಪ್ಲಾಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ (p <0.05 ಮತ್ತು >2-ಪಟ್ಟು ಅಯಾನು ತೀವ್ರತೆ) ಹಾಗೆಯೇ miniSOG-ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ರೇಖೆಗಳಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ಇರುವ ಸಿಂಗಲ್ಟನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು (Fig. 3d ಕೆಂಪು ಮತ್ತು ಹಸಿರು ಚುಕ್ಕೆಗಳು). ಜ್ವಾಲಾಮುಖಿಯ ಪ್ಲಾಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ (p <0.05 ಮತ್ತು >2-ಪಟ್ಟು ಅಯಾನು ತೀವ್ರತೆ) ಹಾಗೆಯೇ miniSOG-ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ರೇಖೆಗಳಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ಇರುವ ಸಿಂಗಲ್ಟನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು (Fig. 3d ಕೆಂಪು ಮತ್ತು ಹಸಿರು ಚುಕ್ಕೆಗಳು). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). ಜ್ವಾಲಾಮುಖಿ ಪ್ಲಾಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು (p<0.05 ಮತ್ತು >2-ಪಟ್ಟು ಅಯಾನು ತೀವ್ರತೆ) ಹಾಗೆಯೇ miniSOG-ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ರೇಖೆಗಳಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ಇರುವ ಏಕ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (Fig. 3d, ಕೆಂಪು ಮತ್ತು ಹಸಿರು ಚುಕ್ಕೆಗಳು)... Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). ಜ್ವಾಲಾಮುಖಿಯ ಕಥಾವಸ್ತುವಿನ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು (p<0.05 ಮತ್ತು >2x ಅಯಾನಿಕ್ ಶಕ್ತಿ) ಹಾಗೂ miniSOG ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಸಾಲಿನಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ಇರುವ ಏಕೈಕ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು (ಚಿತ್ರ 3d ನಲ್ಲಿ ಕೆಂಪು ಮತ್ತು ಹಸಿರು ಚುಕ್ಕೆಗಳು).ಈ ಡೇಟಾವನ್ನು ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸಿ, ನಾವು ಕ್ರಮವಾಗಿ 1364, 461, ಮತ್ತು 911 ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಮಹತ್ವದ ಪರಮಾಣು, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯ ಮತ್ತು ER ಹೊರ ಪೊರೆಯ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಆರ್ಗನೆಲ್ಲೆ-ಸ್ಥಳೀಯ PDPL ನ ನಿಖರತೆಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು, ನಾವು MitoCarta 3.0, ಜೀನ್ ಆಂಟಾಲಜಿ (GO) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು A. ಟಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಇತರರು.73.4, 78.5, ಮತ್ತು 73.0% (Fig. 3e) ನಿಖರತೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಪತ್ತೆಯಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಅಂಗಾಂಗದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾ, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್ ಮತ್ತು ER ಗಾಗಿ ಡೇಟಾ ಸೆಟ್8 ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.PDPL ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯು PDPL ಅಂಗಕ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೋಟೀಮ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಸೂಕ್ತವಾದ ಸಾಧನವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ.ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ಗುರುತಿಸಲಾದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ ಸಬ್‌ಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಸಿಕ್ಕಿಬಿದ್ದ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ಅನ್ನು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಮತ್ತು ಒಳ ಪೊರೆಯಲ್ಲಿ (ಕ್ರಮವಾಗಿ 226 ಮತ್ತು 106) ವಿತರಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ, ಇದು ಒಟ್ಟು ಗುರುತಿಸಲಾದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ 91.7% (362) ರಷ್ಟಿದೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದ PDPL ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ ದೃಢೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 7a).ಅಂತೆಯೇ, ಸಬ್ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಸೆರೆಹಿಡಿಯಲಾದ ಪ್ರೋಟೀಮ್ ಅನ್ನು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಪ್ಲಾಸಂ ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಲಸ್‌ನಲ್ಲಿ ವಿತರಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗ್. 7 ಬಿ).ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಲೋಕಲೈಸೇಶನ್ ಸಿಗ್ನಲ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ (3xNLS) ನೊಂದಿಗೆ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಪ್ರೋಟಿಯೊಮಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು H2B ರಚನೆಗೆ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ Fig. 7c-h) ಇದೇ ರೀತಿಯ ನಿಖರತೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ.PDPL ಮಾರ್ಕರ್‌ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಲ್ಯಾಮಿನಿನ್ A ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ವಿವೇಚನಾಯುಕ್ತವಾಗಿ ಸ್ಥಳೀಕರಿಸಿದ POI7 ಟ್ರ್ಯಾಪ್ ಆಗಿ ಆಯ್ಕೆಮಾಡಲಾಗಿದೆ.PDPL 36 ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದೆ, ಅದರಲ್ಲಿ 12 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು (ಲ್ಯಾಮಿನ್ ಎ ಸೇರಿದಂತೆ 30.0%) ಸ್ಟ್ರಿಂಗ್ ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ನಿಂದ ಟಿಪ್ಪಣಿ ಮಾಡಲಾದ ಲ್ಯಾಮಿನ್ ಎ ಸಂವಾದಾತ್ಮಕ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಾಗಿದ್ದು, ಬಯೋಐಡಿ ವಿಧಾನಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಶೇಕಡಾವಾರು (122 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು) 28 ರಲ್ಲಿ 28. , 22.9 %) 7. ನಮ್ಮ ವಿಧಾನವು ಕಡಿಮೆ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದೆ, ಬಹುಶಃ ಸೀಮಿತ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಪ್ರದೇಶಗಳ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ, ಇದು ಹೆಚ್ಚು ಸಕ್ರಿಯವಾದ ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕದಿಂದ ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು.GO ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಗುರುತಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಪ್ಲಾಸಂ (26), ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಮೆಂಬರೇನ್ (10), ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಮೆಂಬರೇನ್ (9) ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ರಂಧ್ರಗಳಲ್ಲಿ (5) ನೆಲೆಗೊಂಡಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ.ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಈ ಪರಮಾಣು-ಸ್ಥಳೀಯ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ 80% ನಷ್ಟು ಭಾಗವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ, ಇದು PDPL ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 8a-d).
ಅಂಗಕಗಳಲ್ಲಿ ಸಾಮೀಪ್ಯ ಗುರುತು ಮಾಡುವ PDPL ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಿದ ನಂತರ, POI ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪಾಲುದಾರರನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು PDPL ಅನ್ನು ಬಳಸಬಹುದೇ ಎಂದು ನಾವು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ.ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಸೈಟೊಸೊಲಿಕ್ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ PDPL ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲು ನಾವು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಅವುಗಳು ಹೆಚ್ಚು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಸ್ವಭಾವದ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ ಅವುಗಳ ಪೊರೆ-ಸ್ಥಳೀಕೃತ ಪ್ರತಿರೂಪಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಕಷ್ಟಕರವಾದ ಗುರಿಗಳೆಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗಿದೆ.ಬ್ರೊಮೊಡೋಮೈನ್ ಮತ್ತು ಎಕ್ಸ್‌ಟ್ರಾಟರ್ಮಿನಲ್ (BET) ಪ್ರೊಟೀನ್ BRD4 ವಿವಿಧ ಕಾಯಿಲೆಗಳಲ್ಲಿ ಅದರ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರಕ್ಕಾಗಿ ನಮ್ಮ ಗಮನವನ್ನು ಸೆಳೆದಿದೆ 35, 36 .BRD4 ನಿಂದ ರೂಪುಗೊಂಡ ಸಂಕೀರ್ಣವು ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಕೋಕ್ಟಿವೇಟರ್ ಮತ್ತು ಪ್ರಮುಖ ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಗುರಿಯಾಗಿದೆ.c-myc ಮತ್ತು Wnt5a ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಅಂಶಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಮೂಲಕ, BRD4 ತೀವ್ರವಾದ ಮೈಲೋಯ್ಡ್ ಲ್ಯುಕೇಮಿಯಾ (AML), ಮಲ್ಟಿಪಲ್ ಮೈಲೋಮಾ, ಬರ್ಕಿಟ್‌ನ ಲಿಂಫೋಮಾ, ಕೊಲೊನ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಮತ್ತು ಉರಿಯೂತದ ಕಾಯಿಲೆಗಳ ಪ್ರಮುಖ ನಿರ್ಧಾರಕ ಎಂದು ಭಾವಿಸಲಾಗಿದೆ37,38.ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಕೆಲವು ವೈರಸ್‌ಗಳು ವೈರಲ್ ಮತ್ತು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಪ್ರತಿಲೇಖನವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲು BRD4 ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಿಕೊಂಡಿವೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಪ್ಯಾಪಿಲೋಮವೈರಸ್, HIV, ಮತ್ತು SARS-CoV-236,39.
PDPL ಬಳಸಿಕೊಂಡು BRD4 ಸಂವಹನವನ್ನು ಮ್ಯಾಪ್ ಮಾಡಲು, ನಾವು miniSOG ಅನ್ನು BRD4 ನ ಚಿಕ್ಕ N- ಅಥವಾ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಐಸೋಫಾರ್ಮ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಪ್ರೋಟಿಯೊಮಿಕ್ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಎರಡು ರಚನೆಗಳ ನಡುವಿನ ಅತಿಕ್ರಮಣದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದವು (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 9a).miniSOG-H2B ಯೊಂದಿಗೆ ಗುರುತಿಸಲಾದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಪ್ರೋಟೀಮ್ BRD4 ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹಿಸುವ 77.6% ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 9b).ನಂತರ, ಮಾರ್ಕರ್ ತ್ರಿಜ್ಯವನ್ನು ಸರಿಹೊಂದಿಸಲು (Fig. 4a ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಡೇಟಾ 3) ಪ್ರಕಾಶಮಾನದ ವಿವಿಧ ಸಮಯಗಳನ್ನು (2, 5, 10, 20 ನಿಮಿಷಗಳು) ಬಳಸಲಾಯಿತು.ಕಡಿಮೆ ಫೋಟೊಪೀರಿಯಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ, PDPL ಪ್ರಾಥಮಿಕವಾಗಿ ನೇರ ಬಂಧಿಸುವ ಪಾಲುದಾರರನ್ನು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ತೀರ್ಮಾನಿಸುತ್ತೇವೆ, ಆದರೆ ದೀರ್ಘಾವಧಿಯು ಕಡಿಮೆ ಫೋಟೋಆಕ್ಟಿವೇಶನ್ ಅವಧಿಗಳಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಲೇಬಲ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳಲ್ಲಿ ಪರೋಕ್ಷ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ.ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ನಾವು ಪಕ್ಕದ ಸಮಯದ ಬಿಂದುಗಳ ನಡುವೆ ಬಲವಾದ ಅತಿಕ್ರಮಣವನ್ನು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (2 ಮತ್ತು 5 ನಿಮಿಷಗಳಿಗೆ 84.6%; 5 ಮತ್ತು 10 ನಿಮಿಷಗಳಿಗೆ 87.7%; 10 ಮತ್ತು 20 ನಿಮಿಷಗಳಿಗೆ 98.7%) (Fig. 4b ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 9c ).ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಗುಂಪುಗಳಲ್ಲಿ, ನಾವು BRD4 ಸ್ವಯಂ-ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, ಆದರೆ MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A ಮತ್ತು HMGB1 ನಂತಹ ಹಲವಾರು ಗೊತ್ತಿರುವ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಸ್ಟ್ರಿಂಗ್ ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಟಿಪ್ಪಣಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಈ ಗುರಿಗಳ ಅಯಾನಿಕ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವು ಮಾನ್ಯತೆ ಸಮಯಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 4c ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 9d).2-ನಿಮಿಷದ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ GO ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸ್ಥಳೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಕ್ರೊಮಾಟಿನ್ ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಕಾರ್ಯದಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ.ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಆಣ್ವಿಕ ಕಾರ್ಯವು ಕ್ರೊಮಾಟಿನ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅಥವಾ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನಲ್ ಕೋಆಕ್ಟಿವೇಶನ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿದೆ, ಇದು BRD4 ಕಾರ್ಯಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ (Fig. 4d).ಸ್ಟ್ರಿಂಗ್ ಡೇಟಾಬೇಸ್-ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂವಾದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು BRD4 ಮತ್ತು HDAC ಕುಟುಂಬದ ನಡುವಿನ ಪರೋಕ್ಷ ಸಂವಾದಗಳ ಮೊದಲ ಹಂತವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು ಉದಾಹರಣೆಗೆ SIN3A, NCOR2, BCOR, ಮತ್ತು SAP130 (Fig. 4e ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ. 9e), BRD4 ಮತ್ತು HDAC ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅಸಿಟಿಲೇಟೆಡ್ ಹಿಸ್ಟೋನ್‌ಗಳಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ. ..ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, Sin3A, NSUN2, Fus, ಮತ್ತು SFPQ ಸೇರಿದಂತೆ LC-MS/MS ನಿಂದ ಗುರುತಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಪ್ರಾತಿನಿಧಿಕ ಗುರಿಗಳನ್ನು ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟಿಂಗ್ (Fig. 4f) ಮೂಲಕ ದೃಢೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಇತ್ತೀಚೆಗೆ, BRD4 ನ ಸಣ್ಣ ಐಸೋಫಾರ್ಮ್ ದ್ರವ-ದ್ರವ ಹಂತದ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯ (LLPS) ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳೊಂದಿಗೆ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ವರದಿಯಾಗಿದೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳು ಫಸ್ ಮತ್ತು ಎಸ್‌ಎಫ್‌ಪಿಕ್ಯೂ ವಿವಿಧ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳ ಎಲ್‌ಎಲ್‌ಪಿಎಸ್ ಅನ್ನು ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಇಲ್ಲಿ ದಾಖಲಿಸದಿರುವ ಬಿಆರ್‌ಡಿ 4 ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಾಗಿ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ.BRD4 ಮತ್ತು SFPQ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು ಸಹ-ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಶನ್ (ಸಹ-IP) ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ದೃಢೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ (ಚಿತ್ರ 4g), ಇದು BRD4-ಮಧ್ಯಸ್ಥ ದ್ರವ-ದ್ರವ ಹಂತದ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ತನಿಖೆಗೆ ಅರ್ಹವಾದ ಮತ್ತೊಂದು ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಒಟ್ಟಿಗೆ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ತಿಳಿದಿರುವ BRD4 ಸಂವಹನ ಮತ್ತು ಅಜ್ಞಾತ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು PDPL ಒಂದು ಆದರ್ಶ ವೇದಿಕೆಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.
miniSOG-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ BRD4 ಸಾಮೀಪ್ಯ ಗುರುತು, ಮಾನ್ಯತೆ ಸಮಯಗಳು: 2, 5, 10, ಮತ್ತು 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯ.b ವಿವಿಧ ಪ್ರಕಾಶಮಾನ ಸಮಯಗಳಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಅತಿಕ್ರಮಣ.HEK293T-miniSOG-BRD4 ನಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪುಷ್ಟೀಕರಣವು ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ HEK293T ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಮಹತ್ವದ್ದಾಗಿದೆ.c ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸಿದ ಮಾನ್ಯತೆ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಗೊತ್ತಿರದ BRD4-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡದ ಪ್ರತಿನಿಧಿಯನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸುವಾಗ ಅಯಾನು ತೀವ್ರತೆ.n = 3 ಜೈವಿಕವಾಗಿ ಸ್ವತಂತ್ರ ಮಾದರಿಗಳು.ಡೇಟಾವನ್ನು ಸರಾಸರಿ ± ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವಾಗಿ ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.d 2-ನಿಮಿಷದ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಜೀನ್ ಆನ್ಟೋಲಾಜಿಕಲ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (GO).ಮೊದಲ ಹತ್ತು GO ಪದಗಳನ್ನು ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.GO ಪದದ ವರ್ಗಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಗುಳ್ಳೆಗಳನ್ನು ಬಣ್ಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಪದದಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಗೆ ಬಬಲ್ ಗಾತ್ರವು ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿರುತ್ತದೆ.ಇ BRD4 ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಸ್ಟ್ರಿಂಗ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ.ಹಳದಿ ವಲಯಗಳು ನೇರ ಅಂಟು ಮತ್ತು ಬೂದು ವಲಯಗಳು ಪರೋಕ್ಷ ಅಂಟು ಮೊದಲ ಪದರವಾಗಿದೆ.ಕೆಂಪು ರೇಖೆಗಳು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕವಾಗಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾದ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ನೀಲಿ ರೇಖೆಗಳು ಊಹಿಸಲಾದ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ.f LC-MS/MS ನಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪ್ರತಿನಿಧಿ BRD4 ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಗುರಿಗಳನ್ನು ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟಿಂಗ್ ಮೂಲಕ ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಗಿದೆ.g ಕೋ-ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಶನ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳು SFPQ ಮತ್ತು BRD4 ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸುತ್ತವೆ.ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಈ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಸ್ವತಂತ್ರವಾಗಿ ಕನಿಷ್ಠ ಎರಡು ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಗಿದೆ.ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾವನ್ನು ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾ ಫೈಲ್‌ಗಳ ರೂಪದಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ನೋಂದಾಯಿಸದ POI-ಸಂಯೋಜಿತ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವುದರ ಜೊತೆಗೆ, ಕಿಣ್ವಗಳಿಗೆ ತಲಾಧಾರಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು PDPL ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸುತ್ತೇವೆ, ಇದು ನೋಂದಾಯಿಸದ ತಲಾಧಾರಗಳನ್ನು ಟಿಪ್ಪಣಿ ಮಾಡಲು ದೊಡ್ಡ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳಲ್ಲಿ ಪರೋಕ್ಷ ಬಂಧಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ.ಪಾರ್ಕಿನ್ (PARK2 ನಿಂದ ಎನ್‌ಕೋಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ) ಒಂದು E3 ಲಿಗೇಸ್ ಆಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪಾರ್ಕಿನ್‌ನಲ್ಲಿನ ರೂಪಾಂತರಗಳು ಆಟೋಸೋಮಲ್ ರಿಸೆಸಿವ್ ಜುವೆನೈಲ್ ಪಾರ್ಕಿನ್ಸನ್ ಕಾಯಿಲೆಗೆ (AR-JP) ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು ಎಂದು ತಿಳಿದುಬಂದಿದೆ.ಇದರ ಜೊತೆಯಲ್ಲಿ, ಪಾರ್ಕಿನ್ ಮೈಟೊಫಾಗಿಗೆ (ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಆಟೋಫ್ಯಾಜಿ) ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಆಮ್ಲಜನಕ ಪ್ರಭೇದಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಅತ್ಯಗತ್ಯ ಎಂದು ವಿವರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಹಲವಾರು ಪಾರ್ಕಿನ್ ತಲಾಧಾರಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದ್ದರೂ, ಈ ರೋಗದಲ್ಲಿ ಪಾರ್ಕಿನ್ ಪಾತ್ರವು ಅಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿಯೇ ಉಳಿದಿದೆ.ಅದರ ವಿಶಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ತಲಾಧಾರಗಳನ್ನು ಟಿಪ್ಪಣಿ ಮಾಡಲು, PDPL ಅನ್ನು ಪಾರ್ಕಿನ್‌ನ N- ಅಥವಾ C-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ಗೆ miniSOG ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು.PINK1-ಪಾರ್ಕಿನ್ ಮಾರ್ಗದ ಮೂಲಕ ಪಾರ್ಕಿನ್ ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಕಾರ್ಬೊನಿಲ್ ಸೈನೈಡ್ ಪ್ರೋಟಾನ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಪೋರ್ಟರ್ m-ಕ್ಲೋರೊಫೆನೈಲ್ಹೈಡ್ರೋನ್ (CCCP) ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಯಿತು.ನಮ್ಮ BRD4 PDPL ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಪಾರ್ಕಿನ್ N-ಟರ್ಮಿನಸ್ ಸಮ್ಮಿಳನವು ಸಿ-ಟರ್ಮಿನಸ್ (210 ರಲ್ಲಿ 177) (ಚಿತ್ರ 5a,b ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಡೇಟಾ 4) ನ ದೊಡ್ಡ ಭಾಗವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದ್ದರೂ, ಗುರಿಯ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ದೊಡ್ಡ ಗುಂಪನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು.ಫಲಿತಾಂಶವು N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಟ್ಯಾಗ್‌ಗಳು ಪಾರ್ಕಿನ್ 44 ಅನ್ನು ಅಸಹಜವಾಗಿ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಬಹುದು ಎಂಬ ವರದಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ.ಆಶ್ಚರ್ಯಕರವಾಗಿ, ಪಾರ್ಕಿನ್ 43 ಗಾಗಿ ಪ್ರಕಟವಾದ AP-MS ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ನಮ್ಮ ಡೇಟಾದಲ್ಲಿ ಕೇವಲ 18 ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳು ಇದ್ದವು, ಸೆಲ್ ಲೈನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟಿಯೊಮಿಕ್ಸ್ ವರ್ಕ್‌ಫ್ಲೋಗಳ ನಡುವಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿರಬಹುದು.ನಾಲ್ಕು ತಿಳಿದಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಜೊತೆಗೆ (ARDM1, HSPA8, PSMD14, ಮತ್ತು PSMC3) ಎರಡು ವಿಧಾನಗಳಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ (Fig. 5c)43.LC-MS/MS ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಮೌಲ್ಯೀಕರಿಸಲು, HEK293T ಪೋಷಕ ಕೋಶ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರವಾದ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪಾರ್ಕಿನ್ ಲೈನ್‌ನ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಹೋಲಿಸಲು PDPL ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಮತ್ತು ನಂತರದ ಪಾಶ್ಚಾತ್ಯ ಬ್ಲಾಟಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.ಹಿಂದೆ ತಿಳಿದಿಲ್ಲದ ಗುರಿಗಳಾದ CDK2, DUT, CTBP1, ಮತ್ತು PSMC4 ಅನ್ನು ತಿಳಿದಿರುವ ಬೈಂಡರ್, DNAJB1 (Fig. 5d) ನೊಂದಿಗೆ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು.
ಪಾರ್ಕಿನ್‌ನ N- ಅಥವಾ C-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ಗೆ (n = 3 ಸ್ವತಂತ್ರ ಜೈವಿಕ ಪ್ರಯೋಗಗಳು) ಬೆಸೆಯಲಾದ ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಿದ miniSOG ನೊಂದಿಗೆ HEK293T ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ ಪಾರ್ಕಿನ್-ಇಂಟರಾಕ್ಟಿಂಗ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಜ್ವಾಲಾಮುಖಿ ಕಥಾವಸ್ತು.ಜ್ವಾಲಾಮುಖಿ ಪ್ಲಾಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಎರಡು-ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.HEK293T ಅನ್ನು ನಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಬದಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ (p <0.05 ಮತ್ತು >2-ಪಟ್ಟು ಅಯಾನು ತೀವ್ರತೆಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸ). ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಬದಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ (p <0.05 ಮತ್ತು >2-ಪಟ್ಟು ಅಯಾನು ತೀವ್ರತೆಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸ). Значительно изменнные белки выделены krasnыm цветом (p < 0,05 и >2-ಕ್ರ್ಯಾತ್ನಯ ರಝ್ನಿಷಿಯಾ ಮತ್ತು ಇಂಟೆನ್ಸ್ವಿನೊಸ್ಟ್). ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಬದಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ (p <0.05 ಮತ್ತು >2-ಪಟ್ಟು ಅಯಾನು ತೀವ್ರತೆಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸ).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены krasnым цветом (p <0,05 и > 2-ಕ್ರಾಟ್ನಯ ರಝನಿಸಾ ಮತ್ತು ионной силеа). ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಬದಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ (p <0.05 ಮತ್ತು > 2-ಪಟ್ಟು ಅಯಾನಿಕ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದ ವ್ಯತ್ಯಾಸ).HEK293T-miniSOG ಗಾಗಿ ಮುಖ್ಯವಾದ ಸಂಬಂಧಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಹಸಿರು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.b N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಮತ್ತು C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ರಚನೆಗಳ ನಡುವೆ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುವ ವೆನ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ.ಎನ್-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಟ್ಯಾಗ್‌ಗಳು ಪಾರ್ಕಿನ್ ಅನ್ನು ಅಸಹಜವಾಗಿ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚು ಗುರುತಿಸಬಹುದಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು.ಸಿ ವೆನ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರವು PDPL ಮತ್ತು AP-MS ನಡುವಿನ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.18 ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ 4 ಮತ್ತು PDPL ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ 159 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ 11 ಸೇರಿದಂತೆ ತಿಳಿದಿರುವ ಸಂವಾದಕಗಳನ್ನು ಪಟ್ಟಿಮಾಡಲಾಗಿದೆ.d LC-MS/MS ನಿಂದ ಗುರುತಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಪ್ರಾತಿನಿಧಿಕ ಗುರಿಗಳನ್ನು ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟಿಂಗ್‌ನಿಂದ ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಗಿದೆ.e Ssu72 ಮತ್ತು SNW1 ಅನ್ನು ನೋಂದಾಯಿಸದ ಪಾರ್ಕಿನ್ ತಲಾಧಾರಗಳೆಂದು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ.ಈ FLAG-ಟ್ಯಾಗ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ಗಳನ್ನು HEK293T ಮತ್ತು HEK293T-ಪಾರ್ಕಿನ್-ಮಿನಿಎಸ್‌ಒಜಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ವಿವಿಧ ಸಮಯ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ CCCP ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು ಮಾಡಲಾಯಿತು.ಪಾರ್ಕಿನ್ ಮಿತಿಮೀರಿದ ರೇಖೆಯಲ್ಲಿ ಅವನತಿಯು ಹೆಚ್ಚು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿದೆ.ಎಫ್ ಪ್ರೋಟಿಸೋಮ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್ MG132 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, Ssu72 ಮತ್ತು SNW1 ನ ಅವನತಿ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಪ್ರೋಟಿಸೋಮ್-ಸರ್ವವ್ಯಾಪನೆಯಿಂದ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ದೃಢಪಡಿಸಲಾಯಿತು.ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಈ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಸ್ವತಂತ್ರವಾಗಿ ಕನಿಷ್ಠ ಎರಡು ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಗಿದೆ.ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾವನ್ನು ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾ ಫೈಲ್‌ಗಳ ರೂಪದಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, PDPL ಗುರುತಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಪಾರ್ಕಿನ್-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ತಲಾಧಾರಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರಬೇಕು.ನೋಂದಾಯಿಸದ ಪಾರ್ಕಿನ್ ತಲಾಧಾರಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು, ನಾವು ಗುರುತಿಸಲಾದ ಏಳು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ಮತ್ತು SNW1) ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಈ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯ HEK293T ಗೆ ಒಡ್ಡಲು ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ಗಳನ್ನು ವರ್ಗಾಯಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು miniSOG-Parkin's ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುತ್ತೇವೆ.Ssu72 ಮತ್ತು SNW1 ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ ಮಟ್ಟವು ಸ್ಥಿರವಾದ miniSOG-ಪಾರ್ಕಿನ್ ಲೈನ್‌ನಲ್ಲಿ (Fig. 5e) ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ.12 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ CCCP ಯೊಂದಿಗಿನ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ಎರಡೂ ತಲಾಧಾರಗಳ ಅತ್ಯಂತ ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ಅವನತಿಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು.Ssu72 ಮತ್ತು SNW1 ನ ಅವನತಿಯು ಪ್ರೋಟಿಸೋಮ್-ಸರ್ವವ್ಯಾಪನೆಯಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಡುತ್ತದೆಯೇ ಎಂದು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು, ಪ್ರೋಟಿಸೋಮ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಲು ಪ್ರೋಟಿಸೋಮ್ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ MG132 ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ವಾಸ್ತವವಾಗಿ ನಾವು ಅವರ ಅವನತಿ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಿರುವುದನ್ನು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (Fig. 5f).ಹೆಚ್ಚುವರಿ ನಾನ್-ಸಬ್‌ಸ್ಟ್ರೇಟ್ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಪಾಶ್ಚಿಮಾತ್ಯ ಬ್ಲಾಟಿಂಗ್ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗ್. 10) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪಾರ್ಕಿನ್ ಸಂವಾದಕಗಳಾಗಿ ದೃಢೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು LC-MS/MS ನೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ.ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ, ಗುರಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ವರ್ಗಾವಣೆ ಪರಿಶೀಲನೆಯೊಂದಿಗೆ PDPL ವರ್ಕ್‌ಫ್ಲೋನ ಏಕೀಕರಣವು ನೋಂದಾಯಿಸದ E3 ಲಿಗೇಸ್ ತಲಾಧಾರಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ.
ನಾವು ಸಾಮಾನ್ಯ ಸಾಮೀಪ್ಯವನ್ನು ಗುರುತಿಸುವ ವೇದಿಕೆಯನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ ಅದು ನಿಮಗೆ ಸ್ಥಳ ಮತ್ತು ಸಮಯದ ಸಂವಹನ POI ಗಳಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ.ವೇದಿಕೆಯು miniSOG ಫೋಟೋಸೆನ್ಸಿಟೈಸರ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಅನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ, ಇದು ಕೇವಲ 12 kDa ಆಗಿದೆ, ಪ್ರೌಢ APEX2 ಕಿಣ್ವದ (27 kDa) ಅರ್ಧಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಗಾತ್ರ ಮತ್ತು TurboID (35 kDa) ಗಾತ್ರದ ಮೂರನೇ ಒಂದು ಭಾಗ.ಸಣ್ಣ ಗಾತ್ರವು ಸಣ್ಣ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂವಾದಕಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಅನ್ವಯಗಳ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ವಿಸ್ತರಿಸಬೇಕು.ಅನುವಂಶಿಕವಾಗಿ ಎನ್‌ಕೋಡ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಸಣ್ಣ ಅಣುಗಳು, ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕದ ಕ್ವಾಂಟಮ್ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಮತ್ತು ಈ ವಿಧಾನದ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸಲು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಫೋಟೋಸೆನ್ಸಿಟೈಜರ್‌ಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪರಿಶೋಧನೆ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.miniSOG ನ ಪ್ರಸ್ತುತ ಆವೃತ್ತಿಗೆ, ಸಾಮೀಪ್ಯ ಗುರುತುಗಳನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ನೀಲಿ ಪ್ರಕಾಶವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಅನ್ನು ಸಾಧಿಸಬಹುದು.ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ದೀರ್ಘಾವಧಿಯ ಮಾನ್ಯತೆ ಸಮಯವು ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕದ ದೊಡ್ಡ "ಮೋಡ" ವನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಿತು, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚು ದೂರದ ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಅವಶೇಷಗಳ ಮಾರ್ಪಾಡು, ಹೆಚ್ಚಿದ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ತ್ರಿಜ್ಯ ಮತ್ತು PDPL ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಅನ್ನು ಉತ್ತಮಗೊಳಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯ.ಸಿಗ್ನಲ್-ಟು-ಹಿನ್ನೆಲೆ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ನಾವು ಏಳು ರಾಸಾಯನಿಕ ಶೋಧಕಗಳನ್ನು ಸಹ ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಈ ವಿಧಾನದ ಹಿಂದಿನ ಆಣ್ವಿಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಅನ್ವೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ.TOP-ABPP ವರ್ಕ್‌ಫ್ಲೋ ಜೊತೆಗೂಡಿ ಪಕ್ಷಪಾತವಿಲ್ಲದ ಮುಕ್ತ ಹುಡುಕಾಟವು ಹಿಸ್ಟಿಡೈನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳು ಸಂಭವಿಸಿವೆ ಎಂದು ದೃಢಪಡಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ಲೂಪ್ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್‌ಗಳಿಗೆ ಮಧ್ಯಮ ಆದ್ಯತೆಯನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ, ಹೆಚ್ಚಿದ ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳಿಗೆ ಯಾವುದೇ ಸ್ಥಿರವಾದ ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರವನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ.
ಇತರ ಸಾಮೀಪ್ಯ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಆರ್ಗನೆಲ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ರಾಸಾಯನಿಕ ತನಿಖೆ ವಿಧಾನಗಳಿಗೆ ಕನಿಷ್ಠ ಹೋಲಿಸಬಹುದಾದ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ ಮತ್ತು ವ್ಯಾಪ್ತಿಯೊಂದಿಗೆ ಉಪಕೋಶೀಯ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು PDPL ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಮೇಲ್ಮೈ, ಲೈಸೋಸೋಮಲ್ ಮತ್ತು ರಹಸ್ಯ-ಸಂಬಂಧಿತ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ಸಾಮೀಪ್ಯ ಗುರುತುಗಳನ್ನು ಯಶಸ್ವಿಯಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ46,47.PDPL ಈ ಉಪಕೋಶೀಯ ಅಂಗಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ನಂಬುತ್ತೇವೆ.ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಸೈಟೋಸೋಲಿಕ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಾವು PDPL ಗೆ ಸವಾಲು ಹಾಕಿದ್ದೇವೆ, ಅದು ಮೆಂಬರೇನ್ ಬೌಂಡ್ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಸಂಕೀರ್ಣವಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಅವುಗಳ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚು ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ.PDPL ಅನ್ನು ಎರಡು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಅನ್ವಯಿಸಲಾಗಿದೆ, ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನಲ್ ಕೋಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ BRD4 ಮತ್ತು ರೋಗ-ಸಂಬಂಧಿತ ಲಿಗೇಸ್ E3 ಪಾರ್ಕಿನ್.ಈ ಎರಡು ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಅವುಗಳ ಮೂಲಭೂತ ಜೈವಿಕ ಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಮಾತ್ರವಲ್ಲದೆ ಅವುಗಳ ವೈದ್ಯಕೀಯ ಪ್ರಸ್ತುತತೆ ಮತ್ತು ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಸಾಮರ್ಥ್ಯಕ್ಕಾಗಿಯೂ ಆಯ್ಕೆಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಈ ಎರಡು POI ಗಳಿಗೆ, ಪ್ರಸಿದ್ಧ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪಾಲುದಾರರು ಮತ್ತು ನೋಂದಾಯಿಸದ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ.ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ಹಂತ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ-ಸಂಬಂಧಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್ SFPQ ಅನ್ನು ಸಹ-IP ದೃಢೀಕರಿಸಿದೆ, ಇದು BRD4 (ಶಾರ್ಟ್ ಐಸೋಫಾರ್ಮ್) LLPS ಅನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಹೊಸ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಪಾರ್ಕಿನ್ ತಲಾಧಾರಗಳ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಯು ಪರೋಕ್ಷ ಅಂಟುಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಒಂದು ಸನ್ನಿವೇಶವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ನಂಬುತ್ತೇವೆ.ನಾವು ಎರಡು ಗುರುತಿಸಲಾಗದ ಪಾರ್ಕಿನ್ ತಲಾಧಾರಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಸರ್ವತ್ರ-ಪ್ರೋಟೀಸೋಮ್ ಹಾದಿಯಲ್ಲಿ ಅವುಗಳ ಅವನತಿಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಇತ್ತೀಚೆಗೆ, ಹೈಡ್ರೋಲೇಸ್ ತಲಾಧಾರಗಳನ್ನು ಕಿಣ್ವಗಳೊಂದಿಗೆ ಬಲೆಗೆ ಬೀಳಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಯಾಂತ್ರಿಕ-ಆಧಾರಿತ ಬಲೆಗೆ ಬೀಳಿಸುವ ತಂತ್ರವನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ಇದು ಅತ್ಯಂತ ಶಕ್ತಿಯುತ ವಿಧಾನವಾಗಿದ್ದರೂ, ದೊಡ್ಡ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ರಚನೆಯಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ತಲಾಧಾರಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಇದು ಸೂಕ್ತವಲ್ಲ ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವ ಮತ್ತು ತಲಾಧಾರದ ನಡುವಿನ ಕೋವೆಲನ್ಸಿಯ ಬಂಧಗಳ ರಚನೆಯ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ.ಡಿಯುಬಿಕ್ವಿಟಿನೇಸ್ ಮತ್ತು ಮೆಟಾಲೋಪ್ರೊಟೀಸ್ ಕುಟುಂಬಗಳಂತಹ ಇತರ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳು ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವ ಕುಟುಂಬಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು PDPL ಅನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ನಿರೀಕ್ಷಿಸುತ್ತೇವೆ.
SOPP3 ಎಂದು ಕರೆಯಲ್ಪಡುವ miniSOG ನ ಹೊಸ ರೂಪವನ್ನು ಸುಧಾರಿತ ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಮ್ಲಜನಕ ಉತ್ಪಾದನೆಯೊಂದಿಗೆ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ನಾವು miniSOG ಅನ್ನು SOPP3 ನೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಸುಧಾರಿತ ಗುರುತು ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆಯನ್ನು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, ಆದರೂ ಸಿಗ್ನಲ್-ಟು-ಶಬ್ದ ಅನುಪಾತವು ಬದಲಾಗದೆ ಉಳಿದಿದೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 11).SOPP3 ನ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ (ಉದಾ, ನಿರ್ದೇಶನದ ವಿಕಸನದ ಮೂಲಕ) ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾದ ಫೋಟೊಸೆನ್ಸಿಟೈಸರ್ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಅದು ಕಡಿಮೆ ಬೆಳಕಿನ ಸಮಯವನ್ನು ಬಯಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೀಗಾಗಿ ಹೆಚ್ಚು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಸೆರೆಹಿಡಿಯಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ.ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, PDPL ನ ಪ್ರಸ್ತುತ ಆವೃತ್ತಿಯು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಪರಿಸರಕ್ಕೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಇದಕ್ಕೆ ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಕಾಶದ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆಳವಾದ ಅಂಗಾಂಶಗಳನ್ನು ಭೇದಿಸುವುದಿಲ್ಲ.ಈ ವೈಶಿಷ್ಟ್ಯವು ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಮಾದರಿ ಅಧ್ಯಯನಗಳಲ್ಲಿ ಅದರ ಬಳಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, PDPL ನೊಂದಿಗೆ ಆಪ್ಟೊಜೆನೆಟಿಕ್ಸ್ ಸಂಯೋಜನೆಯು ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಸಂಶೋಧನೆಗೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಮೆದುಳಿನಲ್ಲಿ ಒಂದು ಅವಕಾಶವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಇತರ ಇಂಜಿನಿಯರ್ಡ್ ಇನ್ಫ್ರಾರೆಡ್ ಫೋಟೋಸೆನ್ಸಿಟೈಜರ್‌ಗಳು ಸಹ ಈ ಮಿತಿಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತವೆ.ಪ್ರಸ್ತುತ ಈ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಸಂಶೋಧನೆ ನಡೆಯುತ್ತಿದೆ.
HEK293T ಸೆಲ್ ಲೈನ್ ಅನ್ನು ATCC (CRL-3216) ನಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.ಸೆಲ್ ಲೈನ್ ಮೈಕೋಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಸೋಂಕಿಗೆ ಋಣಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಮತ್ತು DMEM (ಥರ್ಮೋ, #C11995500BT) ನಲ್ಲಿ 10% ಭ್ರೂಣದ ಗೋವಿನ ಸೀರಮ್ (FBS, ವಿಸ್ಟೆಕ್, #SE100-B) ಮತ್ತು 1% ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್/ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (Hyclone, #SV30010) ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ.ರಲ್ಲಿ ಬೆಳೆದ.
3-ಅಮಿನೋಫೆನಿಲೀನ್ (ಮಾದರಿ 3) ಮತ್ತು (4-ಎಥೈನೈಲ್ಫೆನಿಲ್) ಮೆಥನಾಮೈನ್ (ಮಾದರಿ 4) ಅನ್ನು ಬಿಡೆಫಾರ್ಮ್‌ನಿಂದ ಖರೀದಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪ್ರೊಪೈಲಮೈನ್ (ತನಿಖೆ 2) ಅನ್ನು ಶಕ್ತಿ-ರಾಸಾಯನಿಕಗಳಿಂದ ಖರೀದಿಸಲಾಗಿದೆ.N-(2-Aminophenyl) ಪೆಂಟ್-4-ynamide (ತನಿಖೆ 1) ಪ್ರಕಟಿತ ವಿಧಾನಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 1 ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಆನುವಂಶಿಕ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡುತ್ತದೆ.miniSOG ಮತ್ತು KillerRed ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು P. Zou (ಪೀಕಿಂಗ್ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾಲಯ) ದ ಉಡುಗೊರೆ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ನಿಂದ ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಗುರಿಯ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು COX4 ನ 23 N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಗಿಬ್ಸನ್ ಅಸೆಂಬ್ಲಿ (Beyotime, #D7010S) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸೂಚಿಸಲಾದ ವೆಕ್ಟರ್‌ಗಳಿಗೆ ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಎಂಡೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ರೆಟಿಕ್ಯುಲಮ್‌ನ ಪೊರೆ ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್ ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಲು, SEC61B ಮಾನವ DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) HEK293T ಜೀವಕೋಶಗಳ cDNA ಲೈಬ್ರರಿಯಿಂದ PCR ನಿಂದ ವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು H2B DNA (D. Lin, Shen by Laboratory ದಾನ) ಮತ್ತು ಮೇಲೆ ತಿಳಿಸಿದಂತೆ ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಬೇರೆ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಸೂಚಿಸದ ಹೊರತು, ವರ್ಗಾವಣೆ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರ ಕೋಶ ರೇಖೆಗಳ ನಿರ್ಮಾಣಕ್ಕಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವ ಇತರ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು HEK293T ಸೆಲ್ cDNA ಲೈಬ್ರರಿಯಿಂದ PCR ವರ್ಧಿಸಲಾಗಿದೆ.G3S (GGGS) ಮತ್ತು G4S (GGGGS) ಅನ್ನು ಬೆಟ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಮತ್ತು miniSOG ನಡುವಿನ ಲಿಂಕ್‌ಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಈ ಸಮ್ಮಿಳನ ರಚನೆಗಳಿಗೆ V5 ಎಪಿಟೋಪ್ ಟ್ಯಾಗ್ (GKPIPNPLLGLDST) ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಸಸ್ತನಿಗಳಲ್ಲಿನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಗಾಗಿ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರವಾದ ಕೋಶ ರೇಖೆಯನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಲು, miniSOG ಸಮ್ಮಿಳನ ರಚನೆಯನ್ನು pLX304 ಲೆಂಟಿವೈರಲ್ ವೆಕ್ಟರ್‌ಗೆ ಉಪಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಗಾಗಿ, ಸಿ-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ 6xHis ಎಂದು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ pET21a ವೆಕ್ಟರ್‌ಗೆ miniSOG ಅನ್ನು ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
HEK293T ಕೋಶಗಳನ್ನು ಆರು-ಬಾವಿ ಫಲಕಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ 2.0 x 105 ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಬಿತ್ತಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 24 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಲೆಂಟಿವೈರಲ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ಗಳು (2.4 μg pLX304) ಮತ್ತು ವೈರಲ್ ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ (1.5 μg psPAX2 ಮತ್ತು 1.2po.G0og ಸಮಯದೊಂದಿಗೆ ಲಿಬಿಪಿಎಕ್ಸ್2 ಮತ್ತು 1.2po.G0μg pB0.00g) ಅನ್ನು ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು. , #C0533), ಸುಮಾರು 80% ಸಮ್ಮಿಳನ.ರಾತ್ರಿಯ ವರ್ಗಾವಣೆಯ ನಂತರ, ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಇನ್ನೊಂದು 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು.ವೈರಸ್ ಸಂಗ್ರಹವನ್ನು 24, 48 ಮತ್ತು 72 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಗುರಿಯ ಜೀವಕೋಶದ ರೇಖೆಗಳ ಸೋಂಕಿನ ಮೊದಲು, ವೈರಲ್ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು 0.8 μm ಫಿಲ್ಟರ್ (ಮೆರ್ಕ್, #ಮಿಲ್ಲೆಕ್ಸ್-ಜಿಪಿ) ಮೂಲಕ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪಾಲಿಬ್ರೆನ್ (ಸೋಲಾರ್ಬಿಯೊ, #H8761) ಅನ್ನು 8 μg/ml ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.24 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುವ ಮೂಲಕ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಚೇತರಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಅನುಮತಿಸಲಾಗಿದೆ.5 μg/ml ಬ್ಲಾಸ್ಟಿಸಿಡಿನ್ (Solarbio, #3513-03-9) ಅನ್ನು ಮೊದಲ ಮೂರು ಭಾಗಗಳಿಗೆ ಕಡಿಮೆ ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾದ ಆಯ್ಕೆಯಾಗಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ನಂತರ 20 μg/ml ಅನ್ನು ಮುಂದಿನ ಮೂರು ಮಾರ್ಗಗಳಿಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಕಠಿಣ ನಿಯಮವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ ಸರಿಸುಮಾರು 20,000 ಕೋಶಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ 12-ಬಾವಿ ಕೋಣೆಗಳಲ್ಲಿ (Ibidi, #81201) ಕೋಶಗಳನ್ನು ಬಿತ್ತಲಾಗಿದೆ.HEK293T ಕೋಶಗಳ ಅಂಟಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು, 50 µg/ml ಫೈಬ್ರೊನೆಕ್ಟಿನ್ (ಕಾರ್ನಿಂಗ್, #356008) ಅನ್ನು ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್ಡ್ ಸಲೈನ್‌ನಲ್ಲಿ (PBS, ಸಾಂಗೋನ್, #B640435) 37 ° C ನಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ.ಕೋಣೆಗಳನ್ನು 1 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಪೂರ್ವಭಾವಿಯಾಗಿ ಸಂಸ್ಕರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ PBS ನೊಂದಿಗೆ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು.24 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, ಕೋಶಗಳನ್ನು PBS ನೊಂದಿಗೆ ಒಮ್ಮೆ ತೊಳೆದು, 1 mM ಪ್ರೋಬ್ 3 ನೊಂದಿಗೆ ತಾಜಾ ಹ್ಯಾಂಕ್ಸ್‌ನ ಸಮತೋಲಿತ ಉಪ್ಪು ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ (HBSS, Gibco, #14025092) 37 ° C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ನೀಲಿ LED (460 nm) ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ. )) ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ವಿಕಿರಣಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.ಅದರ ನಂತರ, ಕೋಶಗಳನ್ನು PBS ನೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ PBS (Sangon, #E672002) ನಲ್ಲಿ 4% ಫಾರ್ಮಾಲ್ಡಿಹೈಡ್ನೊಂದಿಗೆ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಯಿತು.PBS ನೊಂದಿಗೆ ಮೂರು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಫಾರ್ಮಾಲ್ಡಿಹೈಡ್ ಅನ್ನು ಸ್ಥಿರ ಕೋಶಗಳಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ.ನಂತರ ಕೋಶಗಳನ್ನು PBS ನಲ್ಲಿ 0.5% ಟ್ರೈಟಾನ್ X-100 (Sangon, #A600198) ನೊಂದಿಗೆ ವ್ಯಾಪಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು PBS ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಂತರ ಚೇಂಬರ್ ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು 50 µM Cy3-azide (ಅಲಾದಿನ್, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (ಕಾನ್ಫ್ಲೋರ್, #BDJ-4) ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯ 25 µl ಕ್ಲಿಕ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ. ಮತ್ತು 0.5 mg/ml ಸೋಡಿಯಂ ಆಸ್ಕೋರ್ಬೇಟ್ (ಅಲಾದಿನ್, ನಂ. S105024) ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಕ್ಷಿಪ್ರ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಂತರ, 0.05% ಟ್ವೀನ್-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ಹೊಂದಿರುವ PBS ನೊಂದಿಗೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಆರು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಕೊಠಡಿ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ PBST ನಲ್ಲಿ 5% BSA (Abcone, #B24726) ನೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಕೊಲೊಕಲೈಸೇಶನ್ ಇಮ್ಯುನೊಸ್ಟೈನಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ, ಸೂಚಿಸಲಾದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ: ಮೌಸ್ ವಿರೋಧಿ V5 ಟ್ಯಾಗ್ mAb (1:500, CST, #80076), ಮೊಲ ವಿರೋಧಿ Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), ರಾಬಿಟ್ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಆಂಟಿ-ಕ್ಯಾಲ್ನೆಕ್ಸಿನ್ ಪ್ರತಿಕಾಯ (1:500, ಅಬ್‌ಕ್ಯಾಮ್, #ab22595) ಅಥವಾ ಮೊಲದ ವಿರೋಧಿ ಲ್ಯಾಮಿನ್ A/C ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಆಂಟಿಬಾಡಿ (1:500; CST, #2032) ರಾತ್ರಿ 4 °C.PBST ಯೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆದ ನಂತರ, ಕೋಶಗಳನ್ನು ದ್ವಿತೀಯಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು: ಮೇಕೆ ವಿರೋಧಿ ಮೊಲ ಅಲೆಕ್ಸಾ ಫ್ಲೋರ್ 488 (ಥರ್ಮೋ, #A11034) 1:1000 ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿತು, ಮೇಕೆ ವಿರೋಧಿ ಮೌಸ್ ಅಲೆಕ್ಸಾ ಫ್ಲೋರ್ 594 (CST, #8889) 0001 ತೆಳುವಾಗಿದೆ.ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ.ನಂತರ ಕೋಶಗಳನ್ನು PBST ಯೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ PBS ನಲ್ಲಿ DAPI (ಥರ್ಮೋ, #D1306) ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿರೂಪಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.PBS ನೊಂದಿಗೆ 3 ತೊಳೆಯುವಿಕೆಯ ನಂತರ, ಚಿತ್ರಣಕ್ಕಾಗಿ PBS ನಲ್ಲಿ 50% ಗ್ಲಿಸರಾಲ್‌ನಲ್ಲಿ (Sangon, #A600232) ಕೋಶಗಳನ್ನು ಮುಚ್ಚಲಾಯಿತು.ಇಮ್ಯುನೊಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ZEISS LSM 900 Airyscan2 ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ ಮತ್ತು ZNE 3.5 ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಬಳಸಿ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.
ಸಿಂಗಲ್ ಆಕ್ಸಿಜನ್ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಚಿತ್ರಣಕ್ಕಾಗಿ, ಹ್ಯಾಂಕ್ಸ್ HEPES ಬಫರ್ (DOJINDO, #MT05) ನಲ್ಲಿ 100 nM Si-DMA ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೊದಲು ಹ್ಯಾಂಕ್ಸ್ HEPES ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ಬೆಳಕಿಗೆ ಒಡ್ಡಿಕೊಂಡ ನಂತರ, ಕೋಶಗಳನ್ನು CO2 ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟರ್‌ನಲ್ಲಿ 37 ° C ನಲ್ಲಿ 45 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಂತರ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಹ್ಯಾಂಕ್ಸ್‌ನ HEPES ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಹ್ಯಾಂಕ್ಸ್‌ನ HEPES ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ Hoechst ನಿಂದ ಪ್ರತಿರೂಪಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ZEISS LSM 900 ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು., #M36008) ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಮತ್ತು ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಹೊಂದಿರುವ HBSS ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ.ಬೆಳಕು ಅಥವಾ ಡಾಕ್ಸೊರುಬಿಸಿನ್ (MCE, #HY-15142A) ಗೆ ಒಡ್ಡಿಕೊಂಡ ನಂತರ, ಕೋಶಗಳನ್ನು CO2 ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟರ್‌ನಲ್ಲಿ 37 ° C. 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ, HBSS ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ HBSS ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ Hoechst ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಿಮಿಷಗಳು.ಡಾಕ್ಸೊರುಬಿಸಿನ್ ಅನ್ನು ಧನಾತ್ಮಕ ತನಿಖೆ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು, ಅಲ್ಲಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 1% BSA ಹೊಂದಿರುವ HBSS ನಲ್ಲಿ 20 μM ಡಾಕ್ಸೊರುಬಿಸಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಗುತ್ತದೆ.Zeiss LSM 900 ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಇಮ್ಯುನೊಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.
HEK293T ಕೋಶಗಳು ಮಿಟೊ-ಮಿನಿಎಸ್‌ಒಜಿಯನ್ನು ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುತ್ತವೆ, 15 ಸೆಂ.ಮೀ ಭಕ್ಷ್ಯಗಳಲ್ಲಿ ಸುಮಾರು 30% ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಬಿತ್ತಲಾಗಿದೆ.48 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, ~80% ಸಂಗಮವನ್ನು ತಲುಪಿದಾಗ, ಕೋಶಗಳನ್ನು PBS ನೊಂದಿಗೆ ಒಮ್ಮೆ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ, 1 mM ಪ್ರೋಬ್ 3 ನೊಂದಿಗೆ ತಾಜಾ HBSS ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಕೋಣೆಯಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ನೀಲಿ LED ಯಿಂದ ಪ್ರಕಾಶಿಸಲಾಯಿತು. ತಾಪಮಾನ..ಅದರ ನಂತರ, ಕೋಶಗಳನ್ನು PBS ನೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ, EDTA-ಮುಕ್ತ ಪ್ರೋಟಿಯೇಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್‌ಗಳನ್ನು (MCE, #HY-K0011) ಹೊಂದಿರುವ ಐಸ್-ಕೋಲ್ಡ್ PBS ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಸ್ಕ್ರ್ಯಾಪ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಮರುಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ.1 ನಿಮಿಷ (1 ಸೆಕೆಂಡ್ ಆನ್ ಮತ್ತು 1 ಸೆಕೆಂಡ್ ಆಫ್ 35% ವೈಶಾಲ್ಯದಲ್ಲಿ) ತುದಿಯನ್ನು ಧ್ವನಿಸುವ ಮೂಲಕ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಶಿಲಾಖಂಡರಾಶಿಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು 4 ° C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ 15,871 xg ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು BCA ಪ್ರೊಟೀನ್ ಅಸ್ಸೇ ಕಿಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು 4 mg/mL ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ (Beyotime, #P0009).ಮೇಲಿನ ಲೈಸೇಟ್‌ನ 1 ಮಿಲಿ ಅನ್ನು 0.1 mM ಫೋಟೊಡಿಗ್ರೇಡಬಲ್ ಬಯೋಟಿನ್ ಅಜೈಡ್ (ಕಾನ್‌ಫ್ಲೋರ್, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ಲಿಗಾಂಡ್ (ಅಲಾದಿನ್, #T162437), ಮತ್ತು ಕೆಳಭಾಗದಲ್ಲಿ 1 mcubator ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆಯವರೆಗೆ ತಿರುಗುವಿಕೆ.ಕ್ಷಿಪ್ರ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಂತರ, ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಪೂರ್ವ-ಮಿಶ್ರಿತ ದ್ರಾವಣಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಿ (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) 10 ಮಿಲಿ ಗಾಜಿನ ಬಾಟಲಿಯಲ್ಲಿ.ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 4500 ಗ್ರಾಂನಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಮಿಶ್ರಣ ಮತ್ತು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.ಕೆಳಗಿನ ಮತ್ತು ಮೇಲಿನ ದ್ರಾವಣಗಳನ್ನು ತಿರಸ್ಕರಿಸಲಾಯಿತು, ಅವಕ್ಷೇಪವನ್ನು 1 ಮಿಲಿ ಮೆಥನಾಲ್ನೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 4 ° C ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 15871×g ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.ಅವಕ್ಷೇಪವನ್ನು ಕರಗಿಸಲು 25 mM ಅಮೋನಿಯಂ ಬೈಕಾರ್ಬನೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ (ABC, ಅಲ್ಲಾದೀನ್, ನಂ. A110539) 8 M ಯೂರಿಯಾ (ಅಲ್ಲಾದ್ದೀನ್, ಸಂ. U111902) 1 ಮಿಲಿ ಸೇರಿಸಿ.ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 10 mM ಡಿಥಿಯೋಥ್ರೆಟಾಲ್ (Sangon, 25 mM ABC ಯಲ್ಲಿ #A100281) ನೊಂದಿಗೆ 40 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 55 °C ನಲ್ಲಿ ಮರುಸಂಘಟಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ 15 mM ತಾಜಾ iodoacetamide (Sangon, #A600539) ಅನ್ನು ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.30 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ ಆಲ್ಕೈಲೇಶನ್..ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿಲ್ಲಿಸಲು ಹೆಚ್ಚುವರಿ 5 mM ಡಿಥಿಯೋಥ್ರೆಟಾಲ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.1 ಮಿಲಿ PBS ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಗೆ ಸರಿಸುಮಾರು 100 µl ನ್ಯೂಟ್ರಾಅವಿಡಿನ್ ಅಗರೋಸ್ ಮಣಿಗಳನ್ನು (ಥರ್ಮೋ, #29202) ತಯಾರಿಸಿ.ಮೇಲಿನ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು 5 ಮಿಲಿ ಪಿಬಿಎಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಪೂರ್ವ-ತೊಳೆದ ನ್ಯೂಟ್ರಾಅವಿಡಿನ್ ಅಗರೋಸ್ ಮಣಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಂತರ ಮಣಿಗಳನ್ನು 0.2% SDS (Sangon, #A600485) ಹೊಂದಿರುವ 5 ml PBS ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ, 1M ಯೂರಿಯಾವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ 5 ml PBS ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ಮತ್ತು 5 ml ddH2O ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಂತರ ಮಣಿಗಳನ್ನು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಿಂದ ಕೊಯ್ಲು ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 1 M ಯೂರಿಯಾ, 1 mM CaCl 2 (ಮ್ಯಾಕ್ಲಿನ್, #C805228) ಮತ್ತು 20 ng/μl ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ (ಪ್ರೊಮೆಗಾ, #V5280) ಹೊಂದಿರುವ 25 mM ABC ಯ 200 μl ನಲ್ಲಿ ಮರುಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ.ತಿರುಗುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ ಟ್ರಿಪ್ಸಿನೈಜ್ ಮಾಡಿ.pH 2-3 ತಲುಪುವವರೆಗೆ ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು (ಥರ್ಮೋ, # A117-50) ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿಲ್ಲಿಸಲಾಯಿತು.ಮಣಿಗಳನ್ನು 0.2% SDS ಹೊಂದಿರುವ 1 ಮಿಲಿ ಪಿಬಿಎಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ, 1 ಎಂ ಯೂರಿಯಾವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ 1 ಮಿಲಿ ಪಿಬಿಎಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ಮತ್ತು ನಂತರ 1 ಮಿಲಿ ಡಿಸ್ಟಿಲ್ಡ್ ವಾಟರ್‌ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.70% MeOH ನ 200 μl ಬಳಸಿ 90 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಲೈಟ್ ಲೈಸಿಸ್ (365 nm) ಮೂಲಕ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು.ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ನಂತರ, ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು.ಮಣಿಗಳನ್ನು ನಂತರ 70% MeOH ನ 100 μl ನೊಂದಿಗೆ ಒಮ್ಮೆ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪೂಲ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು.ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸ್ಪೀಡ್‌ವಾಕ್ ನಿರ್ವಾತ ಸಾಂದ್ರಕದಲ್ಲಿ ಒಣಗಿಸಿ ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ತನಕ -20 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಸಿಂಗಲ್ಟ್ ಆಕ್ಸಿಜನ್ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು, ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 0.1% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲದಲ್ಲಿ ಪುನಃ ಕರಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 1 μg ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಆರ್ಬಿಟ್ರ್ಯಾಪ್ ಫ್ಯೂಷನ್ ಲುಮೋಸ್ ಟ್ರೈಬ್ರಿಡ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಟ್ಯೂನ್ ಮತ್ತು ಎಕ್ಸ್‌ಕ್ಯಾಲಿಬರ್‌ನಿಂದ ಟ್ಯೂನ್ ಮತ್ತು ಎಕ್ಸ್‌ಕ್ಯಾಲಿಬರ್‌ನಿಂದ ನ್ಯಾನೋ ಇಎಸ್‌ಐ ಮೂಲವನ್ನು ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 75 µm × 15 cm ಆಂತರಿಕವಾಗಿ ಪ್ಯಾಕ್ ಮಾಡಲಾದ ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ಕಾಲಮ್‌ನಲ್ಲಿ 3 µm C18 ವಸ್ತುಗಳೊಂದಿಗೆ (ReproSil-pur, #r13.b9.) ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು EASY-nLC 1200 UHPLC ಸಿಸ್ಟಮ್‌ಗೆ (ಥರ್ಮೋ) ಸಂಪರ್ಕಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ರೇಖೀಯ 95 ನಿಮಿಷಗಳ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿಯಿಂದ 8% ದ್ರಾವಕ B ನಿಂದ 50% ದ್ರಾವಕ B ಗೆ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗಿದೆ (A = 0.1% ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ, B = 0.1% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ 80% ಅಸಿಟೋನೈಟ್ರೈಲ್‌ನಲ್ಲಿ), ನಂತರ ರೇಖೀಯವಾಗಿ 98% B ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಯಿತು. 300 nl/min ಹರಿವಿನ ದರದಲ್ಲಿ 6 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ.ಆರ್ಬಿಟ್ರಾಪ್ ಫ್ಯೂಷನ್ ಲುಮೋಸ್ ಡೇಟಾವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ ಪೂರ್ಣ MS ಸ್ಕ್ಯಾನ್ ಮತ್ತು MS2 ಸ್ಕ್ಯಾನ್ ನಡುವೆ ಪರ್ಯಾಯವಾಗಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುತ್ತದೆ.ಸ್ಪಟ್ಟರಿಂಗ್ ವೋಲ್ಟೇಜ್ ಅನ್ನು 2.1 kV ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅಯಾನು ಸಾರಿಗೆ ಕ್ಯಾಪಿಲರಿಯ ತಾಪಮಾನವು 320 ° C ಆಗಿದೆ.MS ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ (350-2000 m/z) 120,000, AGC 4 × 105, ಮತ್ತು 150 ms ನ ಗರಿಷ್ಠ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಸಮಯದೊಂದಿಗೆ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪ್ರತಿ ಪೂರ್ಣ ಸ್ಕ್ಯಾನ್‌ನಲ್ಲಿನ 10 ಸಾಮಾನ್ಯ ಗುಣಿಸಿ ಚಾರ್ಜ್ಡ್ ಪೂರ್ವಗಾಮಿಗಳನ್ನು 30% ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ ಘರ್ಷಣೆ ಶಕ್ತಿಯೊಂದಿಗೆ, 1.6 m/z ನ ಕ್ವಾಡ್ರುಪೋಲ್ ಐಸೋಲೇಶನ್ ವಿಂಡೋ ಮತ್ತು 30,000 ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಸೆಟ್ಟಿಂಗ್‌ನೊಂದಿಗೆ HCD ಬಳಸಿ ವಿಭಜಿಸಲಾಯಿತು.5×104 ಮತ್ತು ಗರಿಷ್ಠ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಸಮಯ 150 ms ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಟಂಡೆಮ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಗಾಗಿ AGC ಗುರಿ.ಡೈನಾಮಿಕ್ ವಿನಾಯಿತಿಯನ್ನು 30 ಸೆಕೆಂಡುಗಳಿಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. ನಿಯೋಜಿಸದ ಅಯಾನುಗಳು ಅಥವಾ 1+ ಮತ್ತು >7+ ಚಾರ್ಜ್ ಹೊಂದಿರುವವರು MS/MS ಗಾಗಿ ತಿರಸ್ಕರಿಸಲಾಗಿದೆ. ನಿಯೋಜಿಸದ ಅಯಾನುಗಳು ಅಥವಾ 1+ ಮತ್ತು >7+ ಚಾರ್ಜ್ ಹೊಂದಿರುವವರು MS/MS ಗಾಗಿ ತಿರಸ್ಕರಿಸಲಾಗಿದೆ. ನ್ಯಾಸಾನ್ಚೆನಿ ಅಥವಾ ಅಯೋನಿ 1+ ಮತ್ತು >7+ ಬೈಲಿ ಒಟ್ಕ್ಲೋನೆನಿಗಳು MS/MS. MS/MS ಗಾಗಿ 1+ ಮತ್ತು >7+ ಚಾರ್ಜ್‌ನೊಂದಿಗೆ ನಿಯೋಜಿಸದ ಅಯಾನುಗಳು ಅಥವಾ ಅಯಾನುಗಳನ್ನು ತಿರಸ್ಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 ನ್ಯುಕಸಾನಿ ಅಯೋನಿ ಅಥವಾ ಅಯೋನಿ 1+ ಮತ್ತು >7+ ಬೈಲಿ ಒಟ್ಕ್ಲೋನೆನಿಗಳು MS/MS. MS/MS ಗಾಗಿ 1+ ಮತ್ತು >7+ ಚಾರ್ಜ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸದ ಅಯಾನುಗಳು ಅಥವಾ ಅಯಾನುಗಳನ್ನು ತಿರಸ್ಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.
MSFragger ಆಧಾರಿತ FragPipe ಕಂಪ್ಯೂಟಿಂಗ್ ಪ್ಲಾಟ್‌ಫಾರ್ಮ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.-150 ರಿಂದ 500 Da ವರೆಗಿನ ಪೂರ್ವಗಾಮಿ ಸಮೂಹ ಸಹಿಷ್ಣುತೆಯೊಂದಿಗೆ ಮುಕ್ತ ಹುಡುಕಾಟ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಾಮೂಹಿಕ ಪಕ್ಷಪಾತಗಳು ಮತ್ತು ಅನುಗುಣವಾದ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪಿಡಿಯಲ್ಲಿ +229.0964 ಮತ್ತು +247.1069 ಡಾ (ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ಡಿಸ್ಕವರ್ 2.5, ಥರ್ಮೋ) ದ್ರವ್ಯರಾಶಿಯ ಲಾಭಗಳೊಂದಿಗೆ ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಯಿತು.
ಸಮ್ಮಿಳನಗೊಂಡ miniSOG ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಜೀವಕೋಶಗಳು 6 ಸೆಂ.ಮೀ ಭಕ್ಷ್ಯಗಳಲ್ಲಿ ಲೇಪಿತವಾಗಿವೆ.~80% ಸಂಗಮವನ್ನು ತಲುಪಿದ ನಂತರ, ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು HBSS (ಗಿಬ್ಕೊ, #14025092) ನೊಂದಿಗೆ ಒಮ್ಮೆ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ, ನಂತರ HBSS ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ರಾಸಾಯನಿಕ ಶೋಧಕಗಳೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನಿಂದ ಪ್ರಕಾಶಿಸಲಾಯಿತು.ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 10W ಎಲ್ಇಡಿ.PDPL, 0.5 mM ವಿಟಮಿನ್ C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (ಸಿಗ್ಮಾ, #7789-20-0) ನಲ್ಲಿ ಯಾವ ರೀತಿಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಆಮ್ಲಜನಕ ಪ್ರಭೇದಗಳು ಒಳಗೊಂಡಿವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು , 100 mM ಮನ್ನಿಟಾಲ್ (ಎನರ್ಜಿ ಕೆಮಿಕಲ್, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ಅನ್ನು ಜೀವಕೋಶಗಳಿಗೆ ಪೂರಕಗಳಾಗಿ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.ಕೋಲ್ಡ್ PBS ನೊಂದಿಗೆ ತೊಳೆಯುವ ನಂತರ, ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಸ್ಕ್ರ್ಯಾಪ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು, 1.5 ಮಿಲಿ ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಜ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 200 μl PBS ನಲ್ಲಿ 1x ಪ್ರೋಟೀಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್‌ನೊಂದಿಗೆ 1x ಪ್ರೋಟೀಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್‌ನೊಂದಿಗೆ EDTA (1 ಸೆ ಮತ್ತು 1 ಸೆ ಇಲ್ಲದೆ, ವೈಶಾಲ್ಯ 35%) 1 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ ಸೋನಿಕೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು.ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು 4 °C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ 15,871 × g ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು BCA ಪ್ರೊಟೀನ್ ಅಸ್ಸೇ ಕಿಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು 1 mg/mL ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ.ಮೇಲಿನ ಲೈಸೇಟ್‌ನ ಸರಿಸುಮಾರು 50 µl ಅನ್ನು 0.1 mM ರೋಡಮೈನ್ ಅಜೈಡ್ (ಅಲ್ಲಾದ್ದೀನ್, ನಂ. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ಲಿಗಾಂಡ್, ಮತ್ತು 1 mM CuSO4 ನೊಂದಿಗೆ 1 ಗಂಟೆಯ ಕಾಲ ಕೊಠಡಿಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಕೆಳಗಿನಿಂದ ಮೇಲಕ್ಕೆ ತಿರುಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಕ್ಲಿಕ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಂತರ, ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ 250 μl ಪೂರ್ವ-ಶೀತಲವಾಗಿರುವ ಅಸಿಟೋನ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಅಸಿಟೋನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಮಳೆಯನ್ನು ಕೈಗೊಳ್ಳಲಾಗುತ್ತದೆ, 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ -20 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡುವುದು ಮತ್ತು 4 ° C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 6010×g ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸುವುದು.ಉಂಡೆಯನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ ಮತ್ತು 1x Laemmli ಬಫರ್‌ನ 50 µl ನಲ್ಲಿ 95 °C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕುದಿಸಿ.ನಂತರ SDS-PAGE ಉದ್ದದ ಜೆಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಇಮೇಜ್ ಲ್ಯಾಬ್ ಟಚ್ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಬಯೋ-ರಾಡ್ ಕೆಮಿಡಾಕ್ ಎಂಪಿ ಟಚ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು.
ಈ ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಮರುಸಂಯೋಜಕ miniSOG-6xHis ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಣವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, E. coli BL21(DE3) ಜೀವಕೋಶಗಳು (TransGen, #CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis ನೊಂದಿಗೆ ರೂಪಾಂತರಗೊಂಡವು ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168) ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೇರೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ.ಜೀವಕೋಶದ ವಿಘಟನೆಯ ನಂತರ, Ni-NTA ಅಗರೋಸ್ ಮಣಿಗಳನ್ನು (MCE, ನಂ. 70666) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಯಿತು, PBS ವಿರುದ್ಧ ಡಯಾಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿತ್ತು ಮತ್ತು –80 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಪ್ರತಿಕಾಯ-ಆಧಾರಿತ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಲೇಬಲ್ ಸಾಮೀಪ್ಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, PBS ನಲ್ಲಿ 100 μM ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ miniSOG, 1 mM ಪ್ರೋಬ್ 3, ಮತ್ತು 1 μg ಆಂಟಿ-ಲೇಬಲ್ ಮೌಸ್ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಆಂಟಿಬಾಡಿ (TransGen, #HT501-01) ಅನ್ನು ಒಟ್ಟು 50 μl ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಪರಿಮಾಣಕ್ಕೆ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ..ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 0, 2, 5, 10 ಮತ್ತು 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ನೀಲಿ ಎಲ್ಇಡಿ ಬೆಳಕಿನಿಂದ ವಿಕಿರಣಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು 0.1 mM ಬಯೋಟಿನ್-PEG3-ಅಜೈಡ್ (ಅಲ್ಲಾದ್ದೀನ್, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ಲಿಗಾಂಡ್ ಮತ್ತು 1 mM CuSO4 ನೊಂದಿಗೆ 1 ಗಂಟೆಗೆ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಮೇಲ್ಮುಖವಾದ ಚಲನೆಯ ಶೇಕರ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು.ಕ್ಷಿಪ್ರ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಂತರ, 4x ಲೇಮ್ಮ್ಲಿ ಬಫರ್ ಅನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು 95 ° C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕುದಿಸಿ.SDS-PAGE ಜೆಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) ನೊಂದಿಗೆ ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟಿಂಗ್ ಮೂಲಕ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.
C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅಮಿಡೇಶನ್ (LHDALDAK-CONH2) ಜೊತೆಗೆ ಹಿಸ್ಟೈಡಿನ್-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸಿಂಥೆಟಿಕ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು ವಿಟ್ರೊ ಲೇಬಲಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಹತ್ತಿರದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್-ಆಧಾರಿತವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು.ಈ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ, 100 μM ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ miniSOG, 10 mM ಪ್ರೋಬ್ 3 ಮತ್ತು 2 μg/ml ಸಿಂಥೆಟಿಕ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು PBS ನಲ್ಲಿ 50 μl ನ ಒಟ್ಟು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಮಾಣದಲ್ಲಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ನೀಲಿ ಎಲ್ಇಡಿ ಬೆಳಕಿನಿಂದ ವಿಕಿರಣಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.ಒಂದು ಮೈಕ್ರೋಲೀಟರ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು LC-MS ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ (ವಾಟರ್ಸ್, SYNAPT XS ಅಯಾನ್ಸ್ ಮೊಬಿಲಿಟಿ ಟೈಮ್-ಆಫ್-ಫ್ಲೈಟ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ ಜೊತೆಗೆ ಮಾಸ್‌ಲಿಂಕ್ಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ ಅನಾಲಿಸಿಸ್ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್).
HEK293T ಕೋಶಗಳು miniSOG ಸಮ್ಮಿಳನ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುತ್ತವೆ, ವಿವಿಧ ಅಂಗಗಳ ಸ್ಥಳೀಕರಣ (ಮಿಟೊ, ಇಆರ್, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್) ಮತ್ತು ಪಾರ್ಕಿನ್-ಮಿನಿಎಸ್ಒಜಿ ಮತ್ತು ಬಿಆರ್‌ಡಿ 4-ಮಿನಿಎಸ್‌ಒಜಿ ಲೈನ್‌ಗಳಿಗೆ 15 ಸೆಂ.ಮೀ ಭಕ್ಷ್ಯಗಳೊಂದಿಗೆ 10 ಸೆಂ.ಮೀ.~90% ಸಂಗಮವನ್ನು ತಲುಪಿದ ನಂತರ, ಕೋಶಗಳನ್ನು HBSS ನೊಂದಿಗೆ ಒಮ್ಮೆ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ, ನಂತರ 37 ° C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆಗೆ HBSS ನಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಬ್ 3 ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 10 W ನೀಲಿ LED ಯಿಂದ ಪ್ರಕಾಶಿಸಲಾಯಿತು.ಪಾರ್ಕಿನ್‌ನ ಸಂಪರ್ಕವಿಲ್ಲದ ಲೇಬಲಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ, HBSS ನಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಬ್ 3 ನೊಂದಿಗೆ 10 µM ಪ್ರೋಟಾನ್ ಕಾರ್ಬೊನಿಲ್ ಸೈನೈಡ್ ಕ್ಯಾರಿಯರ್ m-ಕ್ಲೋರೊಫೆನೈಲ್ಹೈಡ್ರಜೋನ್ CCCP (Solarbio, #C6700) ಅನ್ನು 37 ° C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆಯವರೆಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.ಸೆಲ್ ಲೈಸಿಸ್, ಕ್ಲಿಕ್ ಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿ, ಕಡಿತ ಮತ್ತು ಅಲ್ಕೈಲೇಶನ್ ಹಂತಗಳು ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತವೆ, 2 ಮಿಗ್ರಾಂ ಲೈಸೇಟ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಫೋಟೊಡಿಗ್ರೇಡಬಲ್ ಬಯೋಟಿನ್ ಅಜೈಡ್ ಬದಲಿಗೆ ಬಯೋಟಿನ್ PEG3 ಅಜೈಡ್ ಅನ್ನು ಕ್ಲಿಕ್ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು.ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ನಂತರ, ಮಣಿಗಳನ್ನು 0.2% SDS ಹೊಂದಿರುವ 5 ml PBS ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ, 1 M ಯೂರಿಯಾವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ 5 ml PBS ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ಮತ್ತು 5 ml PBS ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ಅದರ ನಂತರ, 2 µg ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ ಅನ್ನು 300 µl 25 mM ABC ಗೆ 1 M ಯೂರಿಯಾವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಸೀಳಲು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.2-3 ರ pH ​​ತಲುಪುವವರೆಗೆ ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿಲ್ಲಿಸಲಾಯಿತು.ಮಣಿಗಳ ಮೇಲೆ ಟ್ರಿಪ್ಸಿನೈಸೇಶನ್ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು SOLAµ HRP ಕಾಲಮ್ (ಥರ್ಮೋ, #60209-001) ಬಳಸಿ ಡೀಸಲ್ಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸ್ಪೀಡ್‌ವಾಕ್ ನಿರ್ವಾತ ಸಾಂದ್ರಕದಲ್ಲಿ ಒಣಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು 0.1% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲದಲ್ಲಿ ಪುನಃ ಕರಗಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದ ನ್ಯಾನೊ-ESI ಮೂಲವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಆರ್ಬಿಟ್ರಾಪ್ ಫ್ಯೂಷನ್ ಲುಮೋಸ್ ಟ್ರೈಬ್ರಿಡ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು 500 ng ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ವಾಣಿಜ್ಯ RP-HPLC ಪೂರ್ವಕಾಲಮ್‌ಗಳು (75 μm x 2 cm) (ಥರ್ಮೋ, ಸಂ. 164946) ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಣಾತ್ಮಕ RP-HPLC ಕಾಲಮ್‌ಗಳು (75 μm x 25 cm) (ಥರ್ಮೋ, ಸಂಖ್ಯೆ. 164941) ಮೇಲೆ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ, ಎರಡೂ 2 μm ತುಂಬಿವೆ.60 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 8% ರಿಂದ 35% ACN ಗೆ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್, ನಂತರ 300 Nl/min ಹರಿವಿನ ದರದಲ್ಲಿ 6 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 98% B ಗೆ ರೇಖೀಯವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ.MS ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ (350-1500 m/z) 60,000, AGC 4 × 105, ಮತ್ತು 50 ms ನ ಗರಿಷ್ಠ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಸಮಯದೊಂದಿಗೆ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ.ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿದ ಅಯಾನುಗಳನ್ನು 3 s ಚಕ್ರಗಳಲ್ಲಿ 30% ನ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ ಘರ್ಷಣೆ ಶಕ್ತಿಯೊಂದಿಗೆ HCD ಯಿಂದ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ ವಿಭಜಿಸಲಾಯಿತು, 1.6 m/z ನ ಕ್ವಾಡ್ರುಪೋಲ್ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆ ವಿಂಡೋ, ಮತ್ತು 15000 ರ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್. 5 × 104 ಟಂಡೆಮ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ AGC ಗುರಿ ಮತ್ತು ಗರಿಷ್ಠ ಇನ್ 22 ಎಂಎಸ್ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಡೈನಾಮಿಕ್ ಹೊರಗಿಡುವಿಕೆಯನ್ನು 45 ಸೆಕೆಂಡುಗಳಿಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. ನಿಯೋಜಿಸದ ಅಯಾನುಗಳು ಅಥವಾ 1+ ಮತ್ತು >7+ ಚಾರ್ಜ್ ಹೊಂದಿರುವವರು MS/MS ಗಾಗಿ ತಿರಸ್ಕರಿಸಲಾಗಿದೆ. ನಿಯೋಜಿಸದ ಅಯಾನುಗಳು ಅಥವಾ 1+ ಮತ್ತು >7+ ಚಾರ್ಜ್ ಹೊಂದಿರುವವರು MS/MS ಗಾಗಿ ತಿರಸ್ಕರಿಸಲಾಗಿದೆ. ನ್ಯಾಸಾನ್ಚೆನಿ ಅಥವಾ ಅಯೋನಿ 1+ ಮತ್ತು >7+ ಬೈಲಿ ಒಟ್ಕ್ಲೋನೆನಿಗಳು MS/MS. MS/MS ಗಾಗಿ 1+ ಮತ್ತು >7+ ಚಾರ್ಜ್‌ನೊಂದಿಗೆ ನಿಯೋಜಿಸದ ಅಯಾನುಗಳು ಅಥವಾ ಅಯಾನುಗಳನ್ನು ತಿರಸ್ಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 ನ್ಯುಕಸಾನಿ ಅಯೋನಿ ಅಥವಾ ಅಯೋನಿ 1+ ಮತ್ತು >7+ ಬೈಲಿ ಒಟ್ಕ್ಲೋನೆನಿಗಳು MS/MS. MS/MS ಗಾಗಿ 1+ ಮತ್ತು >7+ ಚಾರ್ಜ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸದ ಅಯಾನುಗಳು ಅಥವಾ ಅಯಾನುಗಳನ್ನು ತಿರಸ್ಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ನ್ಯೂಟ್ರಾಅವಿಡಿನ್ ಮಣಿಗಳ ಪುಷ್ಟೀಕರಣದವರೆಗಿನ ಮಾದರಿ ತಯಾರಿಕೆಯ ಹಂತಗಳು ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದ LC-MS/MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತವೆ.ಸರಿಸುಮಾರು 50 μg ಲೈಸೇಟ್ ಅನ್ನು ಲೋಡಿಂಗ್ ನಿಯಂತ್ರಣಕ್ಕಾಗಿ ಇನ್ಪುಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕ್ಲಿಕ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ 2 mg ಲೈಸೇಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.ನ್ಯೂಟ್ರಾವಿಡಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಮತ್ತು ತೊಳೆಯುವ ನಂತರ, ಅಗರೋಸ್ ರಾಳದ ಮಣಿಗಳಿಗೆ 50 μl ಲೇಮ್ಮ್ಲಿಯ ಬಫರ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು 95 ° C. ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕುದಿಸುವ ಮೂಲಕ ಬೌಂಡ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊರಹಾಕಲಾಯಿತು.ಕಂಟ್ರೋಲ್ ಲೋಡ್ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಮತ್ತು ಮಣಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು SDS-PAGE ಮೂಲಕ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟ್ ವಿಧಾನಗಳಿಂದ PVDF ಮೆಂಬರೇನ್‌ಗಳಿಗೆ (ಮಿಲ್ಲಿಪೋರ್, #ISEQ00010) ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು.ಪೊರೆಗಳನ್ನು 0.1% ಟ್ವೀನ್-20 (TBST) ಹೊಂದಿರುವ TBS ನಲ್ಲಿ 5% ಕೆನೆರಹಿತ ಹಾಲಿನೊಂದಿಗೆ (Sangon, #A600669) ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಮತ್ತು ದ್ವಿತೀಯಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು TBST ಯಲ್ಲಿ 5% ಕೆನೆರಹಿತ ಹಾಲಿನಲ್ಲಿ 1:1000 ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸೆಕೆಂಡರಿ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು 1:5000 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಕೆಮಿಡಾಕ್ ಎಂಪಿ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕೆಮಿಲುಮಿನಿಸೆನ್ಸ್ ಮೂಲಕ ಪೊರೆಗಳನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿನ ಬ್ಲಾಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಜೆಲ್‌ಗಳ ಎಲ್ಲಾ ಕತ್ತರಿಸದ ಸ್ಕ್ಯಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾದಂತೆ ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು ಮೊಲದ ವಿರೋಧಿ SFPQ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಆಂಟಿಬಾಡಿ (CST, ನಂ. 71992), ಮೊಲ ವಿರೋಧಿ FUS ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯ (CST, ನಂ. 67840), ಮೊಲದ ವಿರೋಧಿ NSUN2 ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯ (ಪ್ರೋಟೀನ್ಟೆಕ್, ನಂ. 20854-1-1- AP), ಮೊಲ ವಿರೋಧಿ mSin3A ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯ (Abcam, #ab3479), ಮೌಸ್ ವಿರೋಧಿ ಟ್ಯಾಗ್ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯ (TransGen, #HT201-02), ಮೌಸ್ ವಿರೋಧಿ β-ಆಕ್ಟಿನ್ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯ (ಟ್ರಾನ್ಸ್ಜೆನ್, #HC201-01), ಮೊಲದ ವಿರೋಧಿ -CDK2 ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯ (ABclonal, #A0094), CTBP1 ಗೆ ಮೊಲದ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯ (ABclonal, #A11600), DUT ಗೆ ಮೊಲದ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯ (ABclonal, #A2901), PSMC4 ಗೆ ಮೊಲದ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯ (ABclonal, #A250) DNAJB1 ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯ (ABclonal, # A5504).ಈ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು TBST ಯಲ್ಲಿ 5% ಕೆನೆರಹಿತ ಹಾಲಿನಲ್ಲಿ 1:1000 ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು.ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ದ್ವಿತೀಯಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು 1:5000 ತೆಳುಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಆಂಟಿ-ರಾಬಿಟ್ IgG (ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೆನ್, #HS101-01), ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ IgG (ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೆನ್, #HS201-01) ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿವೆ.
BRD4 SFPQ ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹಿಸುತ್ತದೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು, ಸ್ಥಿರವಾದ HEK293T ಮತ್ತು BRD4-miniSOG ಕೋಶಗಳು HEK293T ಅನ್ನು ಅತಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ 10 ಸೆಂ.ಮೀ ಭಕ್ಷ್ಯಗಳಲ್ಲಿ ಲೇಪಿತವಾಗಿವೆ.ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕೋಲ್ಡ್ PBS ನೊಂದಿಗೆ ತೊಳೆದು 1 ಮಿಲಿ ಪಿಯರ್ಸ್ ಐಪಿ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್, #87787) ಇಡಿಟಿಎ-ಮುಕ್ತ ಪ್ರೋಟೀಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್‌ನೊಂದಿಗೆ 4 ° C ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಅದರ ನಂತರ, ಲೈಸೇಟ್‌ಗಳನ್ನು 1.5 ಮಿಲಿ ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಜ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 4 ° C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 15,871 xg ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು 5 µg ಆಂಟಿ-ವಿ5 ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ಮೌಸ್ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಆಂಟಿಬಾಡಿ (CST, #80076) ನೊಂದಿಗೆ ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಕೊಯ್ಲು ಮತ್ತು ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು.ಸರಿಸುಮಾರು 50 µl ಪ್ರೊಟೀನ್ A/G ಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ಮಣಿಗಳನ್ನು (MCE, #HY-K0202) 0.5% ಟ್ವೀನ್-20 ಹೊಂದಿರುವ PBS ನೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಿರಿ.ನಂತರ ಸೆಲ್ ಲೈಸೇಟ್‌ಗಳನ್ನು 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾಂತೀಯ ಮಣಿಗಳೊಂದಿಗೆ 4 ಡಿಗ್ರಿ ಸೆಲ್ಸಿಯಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಕೆಳಗಿನಿಂದ ಮೇಲಕ್ಕೆ ತಿರುಗುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಂತರ ಮಣಿಗಳನ್ನು 1 ಮಿಲಿ PBST ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ನಾಲ್ಕು ಬಾರಿ ತೊಳೆದು 95 ° C ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕುದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.SDS-PAGE ಜೆಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟ್ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು PVDF ಮೆಂಬರೇನ್‌ಗಳಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಗಿದೆ.TBST ಯಲ್ಲಿ 5% ಕೆನೆರಹಿತ ಹಾಲಿನಲ್ಲಿ ಪೊರೆಗಳನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಮತ್ತು ದ್ವಿತೀಯಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯ ಮೊಲದ ವಿರೋಧಿ SFPQ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು (CST, #71992) TBST ಯಲ್ಲಿ 5% ಕೆನೆರಹಿತ ಹಾಲಿನಲ್ಲಿ 1:1000 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಮೊಲ ವಿರೋಧಿ IgG ಅನ್ನು 1:5000 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಕೆಮಿಡಾಕ್ ಎಂಪಿ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕೆಮಿಲುಮಿನಿಸೆನ್ಸ್ ಮೂಲಕ ಪೊರೆಗಳನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಸಾಲ್ವೆಂಟ್ ಆಕ್ಸೆಸಿಬಲ್ ಸರ್ಫೇಸ್ ಏರಿಯಾ (SASA) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾದ ಎಲ್ಲಾ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಡೇಟಾ ಬ್ಯಾಂಕ್ (PDB) 52 ಅಥವಾ ಆಲ್ಫಾಫೋಲ್ಡ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸ್ಟ್ರಕ್ಚರ್ ಡೇಟಾಬೇಸ್ 53 ನಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.FreeSASA ಪ್ರೋಗ್ರಾಂ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರತಿ ಶೇಷಕ್ಕೆ ಸಂಪೂರ್ಣ SASA ಅನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿ ರಚನೆಗೆ ಸರಾಸರಿ SASA ಪಡೆಯಲು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಮತ್ತು ಅದರ ನೆರೆಹೊರೆಯವರ ಸಂಪೂರ್ಣ ಮತ್ತು ನಿಸ್ಸಂದಿಗ್ಧವಾದ SASA ಡೇಟಾವನ್ನು ಮಾತ್ರ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಪ್ರತಿ ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್‌ಗೆ ಸಂಬಂಧಿತ ದ್ರಾವಕ ಪ್ರವೇಶವನ್ನು (RSA) ದ್ರಾವಕಕ್ಕೆ ಲಭ್ಯವಿರುವ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಗರಿಷ್ಠ ಸಂಭವನೀಯ ಶೇಷ ಮೇಲ್ಮೈ ವಿಸ್ತೀರ್ಣದಿಂದ ಸಂಪೂರ್ಣ SASA ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಭಾಗಿಸುವ ಮೂಲಕ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸರಾಸರಿ RSA 20% ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ ಎಲ್ಲಾ ಹಿಸ್ಟಡಿನ್‌ಗಳನ್ನು ಮರೆಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ವರ್ಗೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ ಬಹಿರಂಗಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ56.
DDA ಮೋಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಪಡೆದ ಕಚ್ಚಾ ಫೈಲ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರೋಟೀಮ್ ಡಿಸ್ಕವರ್ (v2.5) ಅಥವಾ MSfragger (Fragpipe v15.0) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಾಮಾನ್ಯ ಮಾಲಿನ್ಯಕಾರಕಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಸೂಕ್ತವಾದ SwissProt ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಹುಡುಕಲಾಗಿದೆ.ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಎರಡು ಕಾಣೆಯಾದ ಸೀಳು ಸ್ಥಳಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಪೂರ್ಣ ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ ಅಗತ್ಯವಿದೆ, ಕಾರ್ಬಮೊಯ್ಲ್ ಮೆತಿಲೀಕರಣವು ಸ್ಥಿರವಾದ ಮಾರ್ಪಾಡು ಮತ್ತು ಮೆಥಿಯೋನಿನ್ ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಣವು ಡೈನಾಮಿಕ್ ಮಾರ್ಪಾಡು.ಪೂರ್ವಗಾಮಿ ಮತ್ತು ತುಣುಕಿನ ತೂಕದ ಸಹಿಷ್ಣುತೆಗಳನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ 10 ppm ಮತ್ತು 0.02 Da (MS2 ಆರ್ಬಿಟ್ರ್ಯಾಪ್) ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮಾಲಿನ್ಯಕಾರಕ ಹಿಟ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು <1% ನ ತಪ್ಪು ಪತ್ತೆ ದರವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಮಾಲಿನ್ಯಕಾರಕ ಹಿಟ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು <1% ನ ತಪ್ಪು ಪತ್ತೆ ದರವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಪೋಪದಾನಿ ಮಾಲಿನ್ಯಕಾರಕ ಹಿಟ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು <1% ತಪ್ಪು ಪತ್ತೆ ದರವನ್ನು ನೀಡಲು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 ಪೋಪಡಾನಿಯ ಜಗ್ರಿಯಾಜ್ನಿಯಾಸ್ ವೆಸ್ಟ್ವ್ ಬೈಲಿ ಉಡಾಲೆನಿ, ಎ ಬೆಲ್ಕಿ ಓಟಿಫಿಲ್ಟ್ರೊವಾನಿ <ಡಾಸ್ಟಿಜೆನಿಯಾ ಯೂರೋವ್ನಿಯಾ%1 ಮಾಲಿನ್ಯಕಾರಕ ಹಿಟ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು <1% ನ ತಪ್ಪು ಧನಾತ್ಮಕ ದರವನ್ನು ಸಾಧಿಸಲು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಲೇಬಲ್‌ಗಳ ಬಳಕೆಯಿಲ್ಲದೆ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಮೂರು ಜೈವಿಕ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗಳಿಂದ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ವಿಷಯವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.DAVID ಬಯೋಇನ್ಫರ್ಮ್ಯಾಟಿಕ್ಸ್ ರಿಸೋರ್ಸಸ್, MitoCarta 3.0 ಮತ್ತು ಆಲಿಸ್ ಟಿಂಗ್ ಗುಂಪಿನಿಂದ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದ ಮತ್ತು ಪ್ರಕಟಿಸಿದ ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ಗಳಿಂದ ಜೀನ್ ಆಂಟಾಲಜಿ (GO) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಉಪಕೋಶೀಯ ಸ್ಥಳೀಕರಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಜ್ವಾಲಾಮುಖಿ ನಕ್ಷೆಯನ್ನು ಪರ್ಸೀಯಸ್ನಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ (v1.6.15.0). ಎರಡು-ಬದಿಯ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಗಾಗಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಹೇರಳವಾದ ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಹಿಟ್‌ಗಳನ್ನು ಹೇರಳ ಬದಲಾವಣೆಯೊಂದಿಗೆ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ> 2 (ಇತರವಾಗಿ ಹೇಳದ ಹೊರತು) ಮತ್ತು p ಮೌಲ್ಯ <0.05. ಎರಡು-ಬದಿಯ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಗಾಗಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಹೇರಳವಾದ ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಹಿಟ್‌ಗಳನ್ನು ಹೇರಳ ಬದಲಾವಣೆಯೊಂದಿಗೆ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ> 2 (ಇತರವಾಗಿ ಹೇಳದ ಹೊರತು) ಮತ್ತು p ಮೌಲ್ಯ <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. ಎರಡು-ಬಾಲದ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಗಾಗಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ವಿಷಯದ ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಗಳನ್ನು ವಿಷಯ ಬದಲಾವಣೆ > 2 (ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ ಗಮನಿಸದ ಹೊರತು) ಮತ್ತು ap ಮೌಲ್ಯ <0.05 ನೊಂದಿಗೆ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ... Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. ಎರಡು-ಬಾಲದ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಂಶದಲ್ಲಿನ ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆಗಳ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ವಿಷಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳು > 2 (ಇತರವಾಗಿ ಸೂಚಿಸದ ಹೊರತು) ಮತ್ತು p-ಮೌಲ್ಯಗಳು <0.05 ಗೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸ್ಟ್ರಿಂಗ್ ಡೇಟಾಬೇಸ್ ಜೊತೆಗೆ GO ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂವಹನ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಮೂರು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಅಂಕಿಅಂಶಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಗ್ರಾಫ್‌ಪ್ಯಾಡ್ ಪ್ರಿಸ್ಮ್ (ಗ್ರಾಫ್‌ಪ್ಯಾಡ್ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್) ನೊಂದಿಗೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಜ್ವಾಲಾಮುಖಿ ಪ್ಲಾಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪೆರ್ಸಿಯಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ (v1.6.15.0).ಎರಡು ಗುಂಪುಗಳನ್ನು ಹೋಲಿಸಲು, ಎರಡು-ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು p-ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿ ಕನಿಷ್ಠ ಎರಡು ಬಾರಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಸಿಂಗಲ್‌ಟನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಜ್ವಾಲಾಮುಖಿ ಪ್ಲಾಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ನಿಯಂತ್ರಣ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿನ ಅನುಗುಣವಾದ ಕಾಣೆಯಾದ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯ ವಿತರಣೆಯಿಂದ ಪರ್ಸೀಯಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು ಇದರಿಂದ p-ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಬಹುದು.ದೋಷ ಪಟ್ಟಿಗಳು ಸರಾಸರಿ ± ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ.ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಪ್ರೋಟಿಯೊಮಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಲ್ಲಿ, ಕನಿಷ್ಠ ಎರಡು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳಲ್ಲಿ ಕಾಣಿಸಿಕೊಂಡ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಸಮೃದ್ಧಿಯನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ.ಮಾದರಿ ಗಾತ್ರವನ್ನು ಮೊದಲೇ ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿಲ್ಲ.ಪ್ರಯೋಗಗಳು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕವಾಗಿಲ್ಲ.ಪ್ರಯೋಗ ಮತ್ತು ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಸಂಶೋಧಕರು ಕಾರ್ಯಗಳಿಗೆ ಕುರುಡಾಗಿರಲಿಲ್ಲ.
ಅಧ್ಯಯನ ವಿನ್ಯಾಸದ ಕುರಿತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಾಹಿತಿಗಾಗಿ, ಈ ಲೇಖನಕ್ಕೆ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಲಾದ ನೇಚರ್ ರಿಸರ್ಚ್ ರಿಪೋರ್ಟ್ ಅಮೂರ್ತವನ್ನು ನೋಡಿ.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಪಡೆದ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪ್ರೋಟೀಮ್ ಎಕ್ಸ್ಚೇಂಜ್ ಕನ್ಸೋರ್ಟಿಯಂಗೆ iProX57 ಪಾಲುದಾರ ರೆಪೊಸಿಟರಿಯ ಮೂಲಕ ಡೇಟಾಸೆಟ್ ID PXD034811 (PDPL-MS ಡೇಟಾಸೆಟ್) ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಸಲ್ಲಿಸಲಾಗಿದೆ.ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾವನ್ನು ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾ ಫೈಲ್‌ಗಳ ರೂಪದಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಈ ಲೇಖನವು ಮೂಲ ಡೇಟಾವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ನೆರೆಹೊರೆಯನ್ನು ತಿಳಿದುಕೊಳ್ಳುವುದು: ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳು ಮತ್ತು ಮ್ಯಾಪ್ ಅಂಗಕಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ಸಾಮೀಪ್ಯ-ಅವಲಂಬಿತ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವುದು. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ನೆರೆಹೊರೆಯನ್ನು ತಿಳಿದುಕೊಳ್ಳುವುದು: ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳು ಮತ್ತು ಮ್ಯಾಪ್ ಅಂಗಕಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ಸಾಮೀಪ್ಯ-ಅವಲಂಬಿತ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವುದು.ಗಿಂಗ್ರಾಸ್, ಎಎಸ್, ಅಬೆ, ಕೆಟಿ ಮತ್ತು ರೌಟ್, ಬಿ. ಸುತ್ತಮುತ್ತಲಿನ ಪರಿಚಿತತೆ: ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳು ಮತ್ತು ಮ್ಯಾಪ್ ಅಂಗಕಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ಸಾಮೀಪ್ಯ-ಅವಲಂಬಿತ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವುದು. ಗಿಂಗ್ರಾಸ್, AC, ಅಬೆ, KT ಮತ್ತು ರೌಟ್, B. 了解邻里 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ನೆರೆಹೊರೆಯನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವುದು: ಜೈವಿಕ ಜೀವನದ ಮೇಲೆ ನೆರೆಹೊರೆಯ ಅವಲಂಬನೆಯನ್ನು ಬಳಸಿ.ಜಿಂಗ್ರಾಸ್, ಎಎಸ್, ಅಬೆ, ಕೆಟಿ ಮತ್ತು ರೌಟ್, ಬಿ. ಸಾಮೀಪ್ಯವನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವುದು: ಪ್ರೊಟೀನ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು ಮತ್ತು ಸಾಮೀಪ್ಯ-ಅವಲಂಬಿತ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅಂಗಕಗಳ ಮ್ಯಾಪಿಂಗ್.ಪ್ರಸ್ತುತ.ನನ್ನ ಅಭಿಪ್ರಾಯ.ರಾಸಾಯನಿಕ.ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರ 48, 44–54 (2019).
ಗೆರಿ, ಜೆಬಿ ಮತ್ತು ಇತರರು.ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಡೆಕ್ಸ್ಟರ್ ಶಕ್ತಿಯನ್ನು ವರ್ಗಾಯಿಸುವ ಮೂಲಕ ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರವನ್ನು ಮ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಮಾಡುವುದು.ವಿಜ್ಞಾನ 367, 1091–1097 (2020).
ಹರ್ಟ್ಲಿಂಗ್, EL ಮತ್ತು ಇತರರು.ಎರಡು-ಪ್ರೋಟೀಮ್ ಸ್ಕೇಲ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ಗಳು ಮಾನವನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಕೋಶ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆ ಮಾಡುತ್ತವೆ.ಕೋಶಗಳು 184, 3022–3040.e3028 (2021).